從大齡小鼠結(jié)腸固有層中分離純化固有淋巴樣細(xì)胞的方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)涉及細(xì)胞分離純化技術(shù)領(lǐng)域，公開了一種從大齡小鼠結(jié)腸固有層中分離純化固有淋巴樣細(xì)胞的方法，步驟：小鼠結(jié)腸加細(xì)胞解離液孵育；加細(xì)胞消化液孵育，過濾，將結(jié)腸加HBSS中離心，去除上清液加HBSS重懸，并加殼聚糖包覆改性羰基鐵，用金屬過濾網(wǎng)過濾，在過濾時(shí)對過濾網(wǎng)通2～5mA的微弱電流，得過濾液；用44％第一Percoll液重懸后移至底部鋪有67％第二Percoll液的離心管離心；收集中間層細(xì)胞，再離心，收集沉淀；用稀釋后抗體混懸細(xì)胞團(tuán)，離心，收集沉淀；用流式緩沖液重懸沉淀，上機(jī)流式細(xì)胞儀得到固有淋巴樣細(xì)胞。本發(fā)明專利技術(shù)能夠克服大齡小鼠結(jié)腸固有層中結(jié)締組織對固有淋巴樣細(xì)胞的分離純化的影響，提高大齡小鼠腸粘膜中固有淋巴樣細(xì)胞的分離純度和絕對細(xì)胞數(shù)量。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
從大齡小鼠結(jié)腸固有層中分離純化固有淋巴樣細(xì)胞的方法
本專利技術(shù)涉及細(xì)胞分離純化
，尤其涉及一種從大齡小鼠結(jié)腸固有層中分離純化固有淋巴樣細(xì)胞的方法。
技術(shù)介紹
固有淋巴樣細(xì)胞(Innatelymphoidcells，簡稱ILC)是一類近些年來見諸于報(bào)道的特殊淋巴細(xì)胞，缺乏重排的抗原特異性受體。ILC家族主要分為ILC1、ILC2、ILC3、ILCreg，還包括NK細(xì)胞和淋巴組織誘導(dǎo)細(xì)胞(LTi)。目前發(fā)現(xiàn)，ILC可以從組織微環(huán)境中接收其它細(xì)胞的信號，在粘膜表面發(fā)揮著重要的免疫作用。他們可以調(diào)節(jié)組織內(nèi)動(dòng)態(tài)平衡、粘膜和非粘膜組織的炎癥與修復(fù)；其主要存在于小腸、結(jié)腸、肺、皮膚、脂肪組織、淋巴組織等部位。ILC主要通過分泌細(xì)胞因子、通過與間質(zhì)細(xì)胞以及其它免疫細(xì)胞之間的相互作用發(fā)揮效應(yīng)作用。隨著免疫活性細(xì)胞分離方法的進(jìn)步，腸道黏膜免疫得到越來越多的免疫科學(xué)工作者的重視，腸道黏膜免疫的研究已成為免疫學(xué)研究熱點(diǎn)之一。腸道黏膜免疫系統(tǒng)是潛在病原體、食品以及共生菌的共同入口。腸道黏膜免疫系統(tǒng)長期暴露于復(fù)雜的環(huán)境中，因此能夠?qū)κ称泛凸采拇碳ぎa(chǎn)生耐受，同時(shí)對病原體的刺激產(chǎn)生免疫反應(yīng)。腸黏膜主要由上皮層、固有層及漿膜層構(gòu)成，含有種類豐富、數(shù)目繁多的免疫細(xì)胞，是哺乳動(dòng)物識別、捕獲經(jīng)消化道進(jìn)入體內(nèi)的外界病原微生物的重要場所，其功能與感染、腫瘤等多種疾病密切相關(guān)。近年針對ILC的研究逐漸興起，有助于提升抗感染、抗腫瘤等臨床診療水平。對腸黏膜中原代ILC進(jìn)行分離純化是開展此類研究的關(guān)鍵前提條件。申請?zhí)柕腃N201810208300.7的專利申請文件公開了一種從小鼠腸粘膜中分離純化固有淋巴樣細(xì)胞的方法，具體過程包括：獲取動(dòng)物結(jié)腸，經(jīng)清洗、剪碎后置于離心管中，加入上皮剝離液攪拌剝離；移除上清液，加入中和液1，攪拌；移除上清液，加入中和液2，靜置分離；移除上清液，加入消化酶混合液，攪拌消化；加入HBSS離心，移除上清后，用HBSS重懸后過濾；所得濾液離心后用Percoll液重懸后移至底部鋪有Percoll液的離心管；離心，中間層細(xì)胞收集，離心，收集沉淀；用稀釋后抗體混懸所得的細(xì)胞團(tuán)，離心，收集沉淀；用流式緩沖液重懸沉淀，上機(jī)流式細(xì)胞儀得到ILC。上述技術(shù)方法雖然能夠從小鼠腸粘膜中分離純化固有淋巴樣細(xì)胞，但是其只適用于從小齡小鼠(周齡16周以下)的小腸粘膜中分離純化固有淋巴樣細(xì)胞，而對于大齡小鼠(周齡16周以上)，由于大齡小鼠腸粘膜中，尤其是結(jié)腸固有層中的結(jié)締組織較多，在分離純化固有淋巴樣細(xì)胞時(shí)，結(jié)腸固有層中的結(jié)締組織不易分離去除，導(dǎo)致固有淋巴樣細(xì)胞分離后的純度較低，固有淋巴樣細(xì)胞絕對數(shù)量較少，影響后期對固有淋巴樣細(xì)胞的研究。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
有鑒于此，本專利技術(shù)的目的是提供一種從大齡小鼠結(jié)腸固有層中分離純化固有淋巴樣細(xì)胞的方法，能夠克服大齡小鼠結(jié)腸固有層中的結(jié)締組織對固有淋巴樣細(xì)胞的分離純化的影響，提高大齡小鼠結(jié)腸固有層中固有淋巴樣細(xì)胞的分離純度和絕對細(xì)胞數(shù)量，利于固有淋巴樣細(xì)胞的后期研究。本專利技術(shù)通過以下技術(shù)手段解決上述技術(shù)問題：一種從大齡小鼠結(jié)腸固有層中分離純化固有淋巴樣細(xì)胞的方法，包括以下步驟，A1、獲取周齡16～40周小鼠的結(jié)腸，經(jīng)清洗、剪碎后置于離心管中，加入細(xì)胞解離液，在搖床上于37℃攪拌孵育20～30分鐘后進(jìn)行旋渦；A2、去除上清液，再加入細(xì)胞解離液，在搖床上于37℃攪拌孵育20～30分鐘后再次旋渦，得到第一混合液；A3、將再次渦旋混勻后的第一混合液去除上清液，將結(jié)腸轉(zhuǎn)移到0～5℃的PBS溶液中，加入細(xì)胞消化液、0.3～0.5mol/L的氫氧化鐵和0.1～0.2mol/L的氫氧化鋁組成的混合溶液，在搖床上于37℃攪拌孵育20～30分鐘后利用80mm濾網(wǎng)進(jìn)行初濾，得到第二混合液；氫氧化鐵和氫氧化鋁溶液的加入，可以對第一混合液中的部分結(jié)締組織進(jìn)行絮凝，并且可以使得Fe3+、Al3+與部分結(jié)締組織進(jìn)行吸附，使得在進(jìn)行初濾的時(shí)候能夠?qū)⒋蟛糠值慕Y(jié)締組織過濾分離出去，便于下一步結(jié)締組織的精過濾；A4、對第二混合液用100μm濾網(wǎng)進(jìn)行過濾，將結(jié)腸加入HBSS中離心，然后去除上清液之后，再加入HBSS重懸，并加入殼聚糖包覆改性羰基鐵，旋轉(zhuǎn)搖動(dòng)得到第三混合液，對第三混合液使用60～80μm金屬過濾網(wǎng)過濾，在過濾過程中對過濾網(wǎng)通2～5mA的微弱電流，得到過濾液；A5、將步驟A4得到的過濾液離心，然后用44％的第一Percoll液重懸后移至底部鋪有67％的第二Percoll液的離心管，800g離心10～20分鐘；A6、取中間層細(xì)胞收集，再次離心，收集沉淀；A7、用稀釋后抗體混懸步驟6所得的細(xì)胞團(tuán)，離心，收集沉淀；A8、用流式緩沖液重懸沉淀，上機(jī)流式細(xì)胞儀得到固有淋巴樣細(xì)胞。進(jìn)一步，所述步驟A1和A2中細(xì)胞解離液均為D-Hanks+10mMHEPES+5mMEDTA，所述D-Hanks、HEPES、EDTA的體積比為1:1:1。進(jìn)一步，所述步驟A3中細(xì)胞消化液為D-Hanks+500μg/mL膠原酶D+500μg/mLDNase1+0.5U/mL分散酶+2％FBS溶液組成的混合溶液。進(jìn)一步，所述步驟A3中D-Hanks、500μg/mL膠原酶D、500μg/mLDNase1、0.5U/mL分散酶和2％FBS溶液的體積比為1:1:1:1:1。進(jìn)一步，所述步驟A6和A7中再次離心采用20℃、800g離心10～20分鐘。進(jìn)一步，所述稀釋后抗體是指含990μl流式緩沖液與10μl抗體原液，稀釋比為1:100。進(jìn)一步，所述步驟A7中抗體為DAPI、LIN、CD3、CD45、CD90.2或其任意的組合；所述LIN為CD11c、CD19、CD45R/B220、Ly6G/Ly6C、CD11b、FcεRIα、NK1.1或其任意的組合。進(jìn)一步，所述步驟A8中流式緩沖液為PBS+FBS的混合溶液，其中FBS終濃度5％；所述流式細(xì)胞術(shù)策略為DAPI-LIN-CD3-CD45+CD90.2+。進(jìn)一步，所述殼聚糖包覆改性羰基鐵的制備方法，包括以下步驟，B1、按質(zhì)量份數(shù)，取5～8份的納米羰基鐵粉末放入容器中，加入20～30份的無水乙醇，使用超聲分散10～15分鐘，加入10～15份的氨水，然后加熱到35～40℃，在攪拌狀態(tài)下逐滴加加入3～5份的正硅酸乙酯，攪拌均勻后反應(yīng)4～5小時(shí)，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下進(jìn)行抽濾、洗滌并烘干，得到改性羰基鐵；B2、取8～10份的殼聚糖顆粒溶于100～200份的去離子水中，攪拌均勻得到殼聚糖溶液；將殼聚糖溶液以20～30kHz的功率超聲后，加入40～50份的乙酸，在40℃恒溫下攪拌1h，靜置；B3、向步驟B2處理后的殼聚糖溶液中加入30～40份的正己烷，在攪拌狀態(tài)下滴入Span80進(jìn)行預(yù)乳化，然后加入步驟B1中得到的改性羰基鐵和1～2份的三乙烯四胺，40℃恒溫下靜置1～2h；B4、靜置后，以6000～8000r/min的速率攪拌10～20min，然后逐滴加入8～10份的環(huán)氧氯丙烷，40℃恒溫下靜本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.從大齡小鼠結(jié)腸固有層中分離純化固有淋巴樣細(xì)胞的方法，其特征在于：包括以下步驟，/nA1、獲取周齡16～40周小鼠的結(jié)腸，經(jīng)清洗、剪碎后置于離心管中，加入細(xì)胞解離液，在搖床上于37℃攪拌孵育20～30分鐘后進(jìn)行渦旋混勻；/nA2、去除上清液，再加入細(xì)胞解離液，在搖床上于37℃攪拌孵育20～30分鐘后再次渦旋混勻，得到第一混合液；/nA3、將再次渦旋混勻后的第一混合液去除上清液，將結(jié)腸轉(zhuǎn)移到0～5℃的PBS溶液中，加入細(xì)胞消化液、0.3～0.5mol/L的氫氧化鐵和0.1～0.2mol/L的氫氧化鋁組成的混合溶液，在搖床上于37℃攪拌孵育20～30分鐘后利用80mm濾網(wǎng)進(jìn)行初濾，得到第二混合液；/nA4、對第二混合液用100μm濾網(wǎng)進(jìn)行過濾，將結(jié)腸加入HBSS中離心，然后去除上清液之后，再加入HBSS重懸，并加入殼聚糖包覆改性羰基鐵，旋轉(zhuǎn)搖動(dòng)得到第三混合液，對第三混合液使用60～80μm金屬過濾網(wǎng)過濾，在過濾過程中對過濾網(wǎng)通2～5mA的微弱電流，得到過濾液；/nA5、將步驟A4得到的過濾液離心，然后用44％的第一Percoll液重懸后移至底部鋪有67％的第二Percoll液的離心管，800×g離心10～20分鐘；/nA6、取中間層細(xì)胞收集，再次離心，收集沉淀；/nA7、用稀釋后抗體混懸步驟6所得的細(xì)胞團(tuán)，離心，收集沉淀；/nA8、用流式緩沖液重懸沉淀，上機(jī)流式細(xì)胞儀得到固有淋巴樣細(xì)胞。/n...

【技術(shù)特征摘要】
1.從大齡小鼠結(jié)腸固有層中分離純化固有淋巴樣細(xì)胞的方法，其特征在于：包括以下步驟，
A1、獲取周齡16～40周小鼠的結(jié)腸，經(jīng)清洗、剪碎后置于離心管中，加入細(xì)胞解離液，在搖床上于37℃攪拌孵育20～30分鐘后進(jìn)行渦旋混勻；
A2、去除上清液，再加入細(xì)胞解離液，在搖床上于37℃攪拌孵育20～30分鐘后再次渦旋混勻，得到第一混合液；
A3、將再次渦旋混勻后的第一混合液去除上清液，將結(jié)腸轉(zhuǎn)移到0～5℃的PBS溶液中，加入細(xì)胞消化液、0.3～0.5mol/L的氫氧化鐵和0.1～0.2mol/L的氫氧化鋁組成的混合溶液，在搖床上于37℃攪拌孵育20～30分鐘后利用80mm濾網(wǎng)進(jìn)行初濾，得到第二混合液；
A4、對第二混合液用100μm濾網(wǎng)進(jìn)行過濾，將結(jié)腸加入HBSS中離心，然后去除上清液之后，再加入HBSS重懸，并加入殼聚糖包覆改性羰基鐵，旋轉(zhuǎn)搖動(dòng)得到第三混合液，對第三混合液使用60～80μm金屬過濾網(wǎng)過濾，在過濾過程中對過濾網(wǎng)通2～5mA的微弱電流，得到過濾液；
A5、將步驟A4得到的過濾液離心，然后用44％的第一Percoll液重懸后移至底部鋪有67％的第二Percoll液的離心管，800×g離心10～20分鐘；
A6、取中間層細(xì)胞收集，再次離心，收集沉淀；
A7、用稀釋后抗體混懸步驟6所得的細(xì)胞團(tuán)，離心，收集沉淀；
A8、用流式緩沖液重懸沉淀，上機(jī)流式細(xì)胞儀得到固有淋巴樣細(xì)胞。


2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從大齡小鼠結(jié)腸固有層中分離純化固有淋巴樣細(xì)胞的方法，其特征在于：所述步驟A1和A2中細(xì)胞解離液均為D-Hanks+10mMHEPES+5mMEDTA，所述D-Hanks、HEPES、EDTA的體積比為1:1:1。


3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的從大齡小鼠結(jié)腸固有層中分離純化固有淋巴樣細(xì)胞的方法，其特征在于：所述步驟A3中細(xì)胞消化液為D-Hanks+500μg/mL膠原酶D+500μg/mLDNase1+0.5U/mL分散酶+2％FBS溶液組成的混合溶液。


4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的從大齡小鼠結(jié)腸固有層中分離純化固有淋巴樣細(xì)胞的方法，其特征在于：所述步驟A3中D-Hanks、500μg/mL膠原酶D、500μg/mLDNase1、0.5U/mL分散酶和2％FBS溶液的體積比為1:1:1:1:1。
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【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：易龍，糜漫天，候鵬飛，余利，
申請(專利權(quán))人：中國人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：重慶;50