一種免疫細胞NK的凍存液及其活性研究方法技術

本發明專利技術公開了一種免疫細胞NK的凍存液及其活性研究方法，包括免疫細胞NK的分離、細胞NK的無血清體外擴增、分析細胞NK的生長曲線、分析細胞NK表面抗原表達、分析細胞NK周期、免疫細胞NK的凍存及復蘇、免疫細胞各項指標檢測。無血清培養基懸浮培養體系，分離獲得的免疫細胞NK具有較強的增殖能力，利用細胞凍存液1凍存的細胞復蘇后，細胞活性在四種細胞凍存液中的細胞活性最高，在90%以上，流式細胞儀檢測結果表明，凍存前的細胞與凍存復蘇后的細胞的免疫表型無明顯差異，均具有免疫細胞的免疫表型，流式細胞術檢測細胞凋亡實驗表明，細胞凍存液1凍存的細胞復蘇后，晚期凋亡的細胞數最少，且未發生凋亡的細胞數最多。

【技術實現步驟摘要】
一種免疫細胞NK的凍存液及其活性研究方法
本專利技術涉及一種免疫細胞NK的凍存液及其活性研究方法，具體為一種免疫細胞NK的凍存液及其活性研究方法，屬于細胞研究

技術介紹
腫瘤是人類面臨的共性問題，當前尚無有效治愈手段，極大影響了患者生活質量。血液腫瘤并發癥多、治療時間長、藥物不良反應大、手術費高，帶來較大的家庭壓力、社會負擔。NK細胞(Naturalkillercells)是人體防御腫瘤的第一道防線，在固有免疫系統具有重要的作用，不需要提前致敏就可以對腫瘤細胞進行直接殺傷。雖然現在NK細胞已經被用于腫瘤免疫的細胞治療，并在臨床治療腫瘤(如白血病，巴瘤和黑色素瘤)有很好的效果；但不論對第三方細胞庫，還是對配送和應用臨床管理說，NK細胞的長期有效儲存始終是一個問題。
技術實現思路
本專利技術的目的就在于為了解決問題而提供一種免疫細胞NK的凍存液及其活性研究方法。本專利技術通過以下技術方案來實現上述目的：一種免疫細胞NK的凍存液及其活性研究方法，包括以下步驟：步驟一、免疫細胞NK的分離包括以下過程：（1）、在生物安全柜中，將外周血用電動助吸器按照每管不多于35ml，平分至50ml離心管中，設定離心參數升9降7，2000rmp，離心8min；（2）、外周血離心后先吸取上層血漿至50ml離心管中，取四個EP管，每管加入1.0ml血漿，水浴鍋中56℃滅活30min，3000rpm離心10min，取上層血漿至潔凈50ml離心管中，備用；（3）、用NA稀釋血細胞，使得血細胞：NA為1:1。步驟二、細胞NK的無血清體外擴增包括以下步驟：（1）、免疫細胞的起始培養；離心收集全部細胞，用30mlNK培養液（里面添加自體血清1.5ml，5%）重懸，及加2mlNK擴增試劑，設定離心參數，升9降7，2000rpm，離心8min，倒棄剩余上清。用電動助吸器吸取15mlNK細胞培養液至離心管中，懸浮沉淀，吹打混勻后加入培養瓶中，加NK細胞培養液15ml離心管并轉入培養瓶中，水平放置在37℃、7.5%的CO2培養箱中培養。（2）免疫細胞的無血清培養；細胞培養至第3天離心、換液、換瓶：收集細胞離心，1500轉，5分鐘。離心后的細胞沉淀加含5%自體血漿的NK細胞培養液30ml重懸，第4-6天，根據實際生長情況，進行添液，轉移培養袋：第7天計數，細胞數量大于1*108，則加入4ml擴增試劑，如細胞數量在3~8*107則長至第8天再添加擴增試劑。加含5%自體血漿的NK細胞培養液使總細胞濃度在1.0*106Cell/m。培養液體積大于200ml或細胞數量大于1*108，則可以轉移至培養袋培養；第8~11天每天觀察，加含1%自體血漿的NK細胞培養液使得細胞濃度在1*106Cell/ml左右；第12~14天每天觀察，添液使得細胞濃度在2*106Cell/ml左右。當細胞生長至所需數量時即可進行收集使用或凍存。一般情況下，建議13或14天收集細胞。步驟三、分析細胞NK的生長曲線。步驟四、分析細胞NK表面抗原表達。步驟五、分析細胞NK周期。步驟六、免疫細胞NK的凍存及復蘇，實驗組設置有四組免疫細胞NK的凍存實驗和一組對照組，且五組實驗分別凍存10天和30天。步驟七、免疫細胞各項指標檢測。作為本專利技術再進一步的方案：所述步驟一中，混勻后均勻緩慢地加至相應的A液上層，形成完整的界面，設定離心參數升6降4，1600rpm，離心20min，吸棄第一層上清，小心輕柔地將第二層的白色細胞層吸至潔凈50ml離心管中，各管中加NA，稀釋混勻，定容至50ml/管，設定離心參數升9降7，2000rpm，離心8min，吸棄上清，加10mlNA/管，重懸細胞。作為本專利技術再進一步的方案：所述步驟三中，采用臺盼藍染色法檢測細胞活性，并繪制出相應的細胞生長曲線。作為本專利技術再進一步的方案：所述步驟四中，采用流式細胞儀檢測細胞表面CD3、CD56、CD8抗原。作為本專利技術再進一步的方案：所述步驟五中，采用流式細胞儀檢測細胞周期。作為本專利技術再進一步的方案：所述步驟六中，四組實驗組和一組對照組分別是：（1）、細胞凍存液1：A液：20%的20%人血白蛋白，10%的15%右旋糖酐/5%葡萄糖注射液；B液：31.25%勃脈力A（復方電解質注射液），31.25%的5%葡萄糖/0.45%氯化鈉注射液，7.5%DMSO，配置完畢后分裝至15ml離心管，放置-20℃待用；（2）、細胞凍存液2：采用臍帶組織凍存的B液，購置后分裝至15ml離心管，放置-20℃待用；（3）、友康凍存液：購置后分裝至15ml離心管，放置-20℃待用；（4）、亙諾凍存液：購置后分裝至15ml離心管，放置-20℃待用；（5）、對照組：新鮮細胞。作為本專利技術再進一步的方案：所述步驟七中，可以通過核細胞計數、活細胞檢測、集落培養、免疫細胞檢測等對NK免疫細胞進行各項指標檢測。本專利技術的有益效果是：該免疫細胞NK的凍存液及其活性研究方法設計合理，應用無血清培養基懸浮培養體系，分離獲得的免疫細胞NK具有較強的增殖能力，利用細胞凍存液1凍存的細胞復蘇后，細胞活性在四種細胞凍存液中的細胞活性最高，在90%以上，流式細胞儀檢測結果表明，凍存前的細胞與凍存復蘇后的細胞的免疫表型無明顯差異，均具有免疫細胞的免疫表型，流式細胞術檢測細胞凋亡實驗表明，細胞凍存液1凍存的細胞復蘇后，晚期凋亡的細胞數最少，且未發生凋亡的細胞數最多。附圖說明圖1為本專利技術流程示意圖。具體實施方式下面將結合本專利技術實施例中的附圖，對本專利技術實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本專利技術一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本專利技術中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本專利技術保護的范圍。請參閱圖1，一種免疫細胞NK的凍存液及其活性研究方法，包括以下步驟：步驟一、免疫細胞NK的分離包括以下過程：（4）、在生物安全柜中，將外周血用電動助吸器按照每管不多于35ml，平分至50ml離心管中，設定離心參數升9降7，2000rmp，離心8min；（5）、外周血離心后先吸取上層血漿至50ml離心管中，取四個EP管，每管加入1.0ml血漿，水浴鍋中56℃滅活30min，3000rpm離心10min，取上層血漿至潔凈50ml離心管中，備用；（6）、用NA稀釋血細胞，使得血細胞：NA為1:1。步驟二、細胞NK的無血清體外擴增包括以下步驟：（2）、免疫細胞的起始培養；離心收集全部細胞，用30mlNK培養液（里面添加自體血清1.5ml，5%）重懸，及加2mlNK擴增試劑，設定離心參數，升9降7，2000rpm，離心8min，倒棄剩余上清。用電動助吸器吸取15mlNK細胞培養液至離心管中，懸浮沉淀，吹打混勻后加入培養瓶中，加NK細胞培養液15ml本文檔來自技高網...

【技術保護點】
1.一種免疫細胞NK的凍存液及其活性研究方法，其特征在于：包括以下步驟：/n步驟一、免疫細胞NK的分離包括以下過程：/n（1）、在生物安全柜中，將外周血用電動助吸器按照每管不多于35ml，平分至50ml離心管中，設定離心參數升9降7，2000rmp，離心8min；/n（2）、外周血離心后先吸取上層血漿至50ml離心管中，取四個EP管，每管加入1.0ml血漿，水浴鍋中56℃滅活30min，3000rpm離心10min，取上層血漿至潔凈50ml離心管中，備用；/n（3）、用NA稀釋血細胞，使得血細胞：NA為1:1。/n步驟二、細胞NK的無血清體外擴增包括以下步驟：/n（1）、免疫細胞的起始培養；/n離心收集全部細胞，用30ml NK培養液（里面添加自體血清1.5ml，5%）重懸，及加2mlNK擴增試劑，設定離心參數，升9降7，2000rpm，離心8min，倒棄剩余上清。用電動助吸器吸取15mlNK細胞培養液至離心管中，懸浮沉淀，吹打混勻后加入培養瓶中，加NK細胞培養液15ml離心管并轉入培養瓶中，水平放置在37℃、7.5%的CO2培養箱中培養；/n（2）免疫細胞的無血清培養；/n細胞培養至第3天離心、換液、換瓶：收集細胞離心，1500轉，5分鐘。離心后的細胞沉淀加含5%自體血漿的NK細胞培養液30ml重懸，第4-6天，根據實際生長情況，進行添液，轉移培養袋：第7天計數，細胞數量大于1*108，則加入4ml擴增試劑，如細胞數量在3~8*107則長至第8天再添加擴增試劑。加含5%自體血漿的NK細胞培養液使總細胞濃度在1.0*106Cell/m。培養液體積大于200ml或細胞數量大于1*108，則可以轉移至培養袋培養；第8~11天每天觀察，加含1%自體血漿的NK細胞培養液使得細胞濃度在1*106Cell/ml左右；第12~14天每天觀察，添液使得細胞濃度在2*106Cell/ml左右。當細胞生長至所需數量時即可進行收集使用或凍存。一般情況下，建議13或14天收集細胞；/n步驟三、分析細胞NK的生長曲線；/n步驟四、分析細胞NK表面抗原表達；/n步驟五、分析細胞NK周期；/n步驟六、免疫細胞NK的凍存及復蘇，實驗組設置有四組免疫細胞NK的凍存實驗和一組對照組，且五組實驗分別凍存10天和30天；/n步驟七、免疫細胞各項指標檢測。/n...

【技術特征摘要】
1.一種免疫細胞NK的凍存液及其活性研究方法，其特征在于：包括以下步驟：
步驟一、免疫細胞NK的分離包括以下過程：
（1）、在生物安全柜中，將外周血用電動助吸器按照每管不多于35ml，平分至50ml離心管中，設定離心參數升9降7，2000rmp，離心8min；
（2）、外周血離心后先吸取上層血漿至50ml離心管中，取四個EP管，每管加入1.0ml血漿，水浴鍋中56℃滅活30min，3000rpm離心10min，取上層血漿至潔凈50ml離心管中，備用；
（3）、用NA稀釋血細胞，使得血細胞：NA為1:1。
步驟二、細胞NK的無血清體外擴增包括以下步驟：
（1）、免疫細胞的起始培養；
離心收集全部細胞，用30mlNK培養液（里面添加自體血清1.5ml，5%）重懸，及加2mlNK擴增試劑，設定離心參數，升9降7，2000rpm，離心8min，倒棄剩余上清。用電動助吸器吸取15mlNK細胞培養液至離心管中，懸浮沉淀，吹打混勻后加入培養瓶中，加NK細胞培養液15ml離心管并轉入培養瓶中，水平放置在37℃、7.5%的CO2培養箱中培養；
（2）免疫細胞的無血清培養；
細胞培養至第3天離心、換液、換瓶：收集細胞離心，1500轉，5分鐘。離心后的細胞沉淀加含5%自體血漿的NK細胞培養液30ml重懸，第4-6天，根據實際生長情況，進行添液，轉移培養袋：第7天計數，細胞數量大于1*108，則加入4ml擴增試劑，如細胞數量在3~8*107則長至第8天再添加擴增試劑。加含5%自體血漿的NK細胞培養液使總細胞濃度在1.0*106Cell/m。培養液體積大于200ml或細胞數量大于1*108，則可以轉移至培養袋培養；第8~11天每天觀察，加含1%自體血漿的NK細胞培養液使得細胞濃度在1*106Cell/ml左右；第12~14天每天觀察，添液使得細胞濃度在2*106Cell/ml左右。當細胞生長至所需數量時即可進行收集使用或凍存。一般情況下，建議13或14天收集細胞；
步驟三、分析細胞NK的生長曲線；
步驟四、分析細胞NK表面抗原表達；
步驟五、分析細胞NK周期；
步驟六、免疫細胞NK的凍存及復蘇，實驗組設置有四組免疫細胞NK的凍存實驗和...

【專利技術屬性】
技術研發人員：李雯雯，陳艷普，凡苗振，袁浩，
申請(專利權)人：河南省銀豐生物工程技術有限公司，銀豐生物工程集團有限公司，
類型：發明
國別省市：河南;41