本發明專利技術提供了一種用于分離培養高純度NK細胞的試劑盒，它包含培養基1?3，本發明專利技術還提供了一種高純度NK細胞的分離培養方法。利用本發明專利技術提供的試劑盒及分離培養方法，可以高效獲得滿足臨床使用的NK細胞，細胞數量多，純度高、殺傷活性好，在同種異體NK回輸方面具有突出優勢，應用前景良好。
【技術實現步驟摘要】
一種高純度NK細胞的分離培養方法本專利技術為申請日：2017年9月5日，申請號：201710791174.8，專利名稱：一種高純度NK細胞的分離培養方法的分案。
本專利技術屬于細胞生物學領域，具體涉及一種高純度NK細胞的分離培養方法。
技術介紹
自然殺傷細胞(naturalkillercell，NK)是機體重要的免疫細胞，作為機體防御體系的第一道防線，不僅可以在天然免疫系統發揮其主要殺瘤效應，而且在免疫反應的早期可以分泌不同的細胞因子和各種趨化因子來調節機體獲得性免疫應答，是機體發揮免疫效應不可或缺的效應細胞。近年來，NK細胞因其細胞殺傷活性高，起效快，且不受MHC限制等優點，相對于αβT細胞，γδT細胞和CIK等其它用于免疫治療的細胞NK細胞受到了更廣泛的關注和臨床應用。但是NK細胞數量較少，在外周血中僅占淋巴細胞的10％-15％，在臍帶血中NK的含量更低，只有5％左右，正常人體外周血中和臍帶血中NK細胞含量遠遠不能滿足臨床治療的需要。NK細胞的數量和純度是臨床療效的重要影響因素，NK細胞數量太少不能達到治療的效果，純度低則會影響對腫瘤的殺傷作用。尤其是臨床上多采用健康供者的血液來制備NK，然后采用同種異體回輸以達到治療目的，這就對所回輸NK細胞的純度要求比較高，如果其中混入過多T細胞B細胞等雜細胞則會引起機體的排斥反應。因此，如何分離制備得到高質量高純度的NK細胞成為其臨床應用中亟待解決的問題。目前，國內外已經有大量的研究者進行了人NK細胞的培養和生物治療方面的研究，但培養得到的NK細胞存在數量較少、或純度較低、或殺傷活性低等問題，不能滿足實際應用的需要。例如：公開號為CN102268405A的專利申請，報道了一種NK細胞體外活化擴增培養的方法，其培養過程中不僅需要添加飼養細胞，雖然可在體外大量擴增NK細胞，但是安全性問題和回輸到體內后并無飼養層細胞，體內和體外環境的差異對NK細胞在體內的擴增和殺傷活性的影響是其無法回避的問題。公開號為CN104928242A的專利申請報道了一種NK細胞的培養方法，培養15天后，NK細胞僅擴增139.5倍，數量仍較少，而且殺傷活性較低。公開號為CN103627672A的專利申請報道的NK細胞體外培養方法，得到的培養產物中，NK細胞僅擴增102.81±94.06倍，而且采用傳統的Ficoll法密度梯度離心法分離NK細胞，數量和純度不佳。因此，急需對NK細胞的制備方法進一步改進，以制備高產量、高純度、殺傷活性好的NK細胞。
技術實現思路
本專利技術旨在克服現有外周血/臍帶血NK細胞體外分離、純化、擴增方法的不足，提供一種高產量、高純度NK細胞的分離培養方法。本專利技術提供了一種用于分離培養高純度NK細胞的試劑盒，它包含培養基1-3；其中，培養基1是在無血清培養基中，添加終濃度為500-1000U/mL的IL-2、終濃度為30-50μg/mL的IL-15和終濃度為5-10％的添加物組成；培養基2是在無血清培養基中，添加終濃度為500-1000U/mL的IL-2組成；培養基3是在無血清培養基中，添加終濃度為500-1000U/mL的IL-2和終濃度為5-10％的添加物組成；其中，所述無血清培養基為淋巴細胞培養用無血清培養基；所述添加物為：自體血漿、胎牛血清或市售血清替代物。淋巴細胞培養用無血清培養基：即適合淋巴細胞生長的無血清培養基。自體血漿：指與所取NK細胞為同一個體的血漿；自體血漿作為NK細胞分離中的副產物，可用于后續的NK細胞活化培養。其中，所述淋巴細胞培養用無血清培養基為AIM-V培養基、X-VIVO15培養基、GT-T551H3培養基或Alys-505N培養基。其中，它包含培養基1-3；其中，培養基1是在無血清培養基中，添加終濃度為500U/mL的IL-2、終濃度為30μg/mL的IL-15和終濃度為10％的自體血漿組成；培養基2是在無血清培養基中，添加終濃度為500U/mL的IL-2組成；培養基3是在無血清培養基中，添加終濃度為500U/mL的IL-2和終濃度為5％的自體血漿組成。本專利技術還提供了一種高純度NK細胞的分離培養方法，它使用了上述試劑盒，步驟如下：a、取人外周血或臍帶血，利用RosetteSepEnrichmentCocktail富集NK細胞；b、Herceptin包被培養瓶，備用；c、對步驟a得到的NK細胞，加入培養基1，37℃下孵育30min，然后取未貼壁的細胞懸液轉入步驟b已包被抗體的培養瓶中，培養；d、第3天，加入等體積培養基2，繼續培養；第6天，加入培養基3，繼續培養；每2天加入培養基2，培養至14天，即可。其中，步驟a中，富集方法如下：(1)取外周血或臍帶血，抗凝后離心，吸取上清血漿滅活，再次離心；棄去沉淀，用PBS補充血漿的量，混勻；(2)按每毫升抗凝血加入RosetteSepTMEnrichmentCocktail50ul，混勻，室溫孵育20分鐘；(3)用PBS+2％FBS溶液重懸，混勻后加至淋巴分離液上，離心，收集白膜層細胞；然后用PBS+2％FBS溶液洗滌兩次，收集細胞沉淀，即可。其中，步驟(1)中，抗凝后離心的條件為800g，8min；再次離心的條件為600g，10min。其中，步驟(1)中，滅活的方法為：56℃水浴30min。其中，步驟(2)中，離心的條件為：1200g，20min。其中，步驟b中，包被方法如下：PBS稀釋Herceptin，至Herceptin濃度為20-50μg/mL，加入培養瓶中，使Herceptin均勻鋪滿底面，于37℃孵育2小時或4℃過夜；使用前用PBS清洗兩次；優選地，Herceptin濃度為20μg/mL。本專利技術還提供了上述方法制備的NK細胞產物。本專利技術方法具有如下優點：1、本專利技術方法得到的NK細胞純度高達98％以上，排除了T細胞，Treg細胞，B細胞的污染，對腫瘤細胞的殺傷活性高，可滿足美國NHLBI(Nationalheart,lungandbloodInsititute)用于同種異體回輸的標準(CD3-CD56+NK細胞達到90％以上，CD19+B細胞和CD3+T細胞低于5％)，不但可用于自體NK回輸，也可以用于同種異體NK的回輸。2、本專利技術方法不需要在整個培養階段都添加多種活化因子，只在前三天活化誘導的時候加入IL15和IL2激活NK細胞，在后期的培養中只需維持IL2的濃度無需添加IL15，降低了培養成本，適用于臨床大規模培養。3、本專利技術方法培養過程中不依賴于飼養細胞,提高了使用安全性，同時避免了回輸后由于體內和體外環境的差異對NK細胞在體內的擴增和殺傷活性的影響。4、本專利技術方法分離純化及體外擴增時間短；而且操作簡單，減少了中間環節污染的可能性。因此，本專利技術提供的試劑盒及分離培養方法，可以從外周血或臍帶血中高效獲得滿足本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.NK細胞三階段使用的培養基組合，其特征在于，/n所述培養基組合包含培養基1、培養基2和培養基3，所述培養基2和培養基3不含IL-15,所述培養基1在NK細胞生長的前兩天使用，所述培養基2在NK細胞生長的第3-5天和第8-14天使用，所述培養基3在NK細胞生長的第6天使用；/n所述培養基1是在無血清培養基中，添加終濃度為500U/mL的IL-2、終濃度為30μg/mL的IL-15和終濃度為10％的自體血漿組成；/n所述培養基2為終濃度為500U/mL的IL-2組成；/n所述培養基3為終濃度為500U/mL的IL-2和終濃度為5％的自體血漿組成。/n
【技術特征摘要】
1.NK細胞三階段使用的培養基組合，其特征在于，
所述培養基組合包含培養基1、培養基2和培養基3，所述培養基2和培養基3不含IL-15,所述培養基1在NK細胞生長的前兩天使用，所述培養基2在NK細胞生長的第3-5天和第8-14天使用，所述培養基3在NK細胞生長的第6天使用；
所述培養基1是在無血清培養基中，添加終濃度為500U/mL的IL-2、終濃度為30μg/mL的IL-15和終濃度為10％的自體血漿組成；
所述培養基2為終濃度為500U/mL的IL-2組成；
所述培養基3為終濃度為500U/mL的IL-2和終濃度為5％的自體血漿組成。
2.含有權利要求1所述的培養基組合的NK細胞的體系，其特征在于，所述NK細胞為經過RosetteSepTMEnrichmentCocktail法初步分離純化而得的純化NK細胞。
3.根據權利要求1所述的體系，其特征在于，所述純化NK細胞的CD3-CD56+NK細胞比率達到88.3％。
4.根據權利要求2所述的體系，其特征在于，所述純化NK細胞與所述培養基1共存2天，得活化NK細胞。
5.根據權利要求4所述的體系，其特征在于，用培養基2替換培養基1，讓所述活化NK細胞與所述培養基2在第3-5天共存，得擴增NK細胞。
6.根據權利要求5所述的體系，其特征在于，用培養基3替換培養基2，讓所述擴增N...
【專利技術屬性】
技術研發人員：楊本艷姿，李雪蓮，陳強，
申請(專利權)人：四川新生命干細胞科技股份有限公司，
類型：發明
國別省市：四川;51
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