具有可預測和穩定的轉基因表達的SSI細胞及形成方法技術

描述了包含整合在高整合基因座內的重組靶位點的哺乳動物細胞。還描述了摻入哺乳動物細胞的重組蛋白生產細胞系和用于形成哺乳動物細胞的方法。通過對哺乳動物細胞中的染色質的三維層次結構的理解和映射，已經開發出高整合基因座。高整合基因座存在于轉錄活性環境中，其可以提供染色質可及性和表觀遺傳穩定性。因此，重組哺乳動物細胞可以提供可預測的和穩定的轉基因生產。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】具有可預測和穩定的轉基因表達的SSI細胞及形成方法相關申請的交叉引用本申請要求申請日為2018年10月1日的美國臨時專利申請序列第62/739,546號的申請權益，該申請通過引用并入本文用于所有目的。
技術介紹
在宿主細胞中整合重組蛋白(rP)表達盒以表達異源多肽已經進行了許多年。傳統上，使用隨機整合(RI)過程，其利用基因組中現有的雙鏈斷裂來摻入表達盒。不幸的是，由于位置花斑效應，在RI過程中，整合的基因拷貝數和整合位點處的表達特征都可能高度可變，從而產生不期望的表型異質性。因此，在開發有用的細胞系時，RI過程需要對整合事件進行昂貴的篩選。此外，用于增加表達的基因擴增方法可以引起基因組中的不穩定性(例如，缺失、重復、易位)以及表達修飾表觀遺傳作用(例如，甲基化、組蛋白修飾、異染色質侵入)。因此，RI產生的細胞系通常不穩定，并且隨著時間的推移顯示出降低的產量。最近，已經開發了位點特異性整合(SSI)，其中通過整合來自位點特異性重組酶系統諸如釀酒酵母衍生的FLP-Frt系統或噬菌體P1衍生的Cre-loxP系統的重組靶位點(RTS)，在細胞基因組中形成“著陸墊”。在SSI細胞系中整合盒的過程被稱為重組酶介導的盒交換(RMCE)。RMCE通常涉及共轉染編碼重組酶的表達載體以及含有目的基因(GOI)的靶向表達載體，所述目的基因的側翼是重組酶靶向序列。通過在待交換的盒的5′端和3′端使用不同RTS(在供體和靶DNA中)，SSI整合方法可以確保重組以定向方式發生，并且僅交換優選的盒區域。不幸的是，SSI生成的細胞系也可能具有局限性。例如，SSI系統需要將RTS插入到基因組中，作為載體靶向和生成表達GOI的細胞系的先決條件。RTS插入通常通過RI或進入有限數量的特定基因組區域來進行，并且因此所得的細胞系仍然存在不穩定性和隨著時間的推移降低的產量。此外，SSI通常導致整合的基因拷貝數低，這可能間接地限制rP生產滴度。增加重組基因的整合的拷貝的一種方法被稱為累積性或積累性SSI(參見例如Kameyamaetal.Biotechnol.Bioeng.105：1106-14(2010)、Kawabeetal.Cytotechnology64：267-79(2012)和Turanetal.J.Mol.Biol.402：52-69(2010))。這種方法可以包含重復的RMCE循環，以在單個位點上依次裝載rP表達盒的多個拷貝。本領域所需要的是在宿主細胞的基因組中轉錄活性和高度穩定的基因座處摻入RTS的SSI細胞系。這種細胞系將能夠穩定和長期表達GOI。在本文中引用了出版物、專利和專利申請，其公開通過引用以其整體并入本文。
技術實現思路
本公開基于這樣的認識，即來自轉基因插入位點的轉錄輸出及其表達系統的穩定性將受到該區域中染色質的3維(3D)結構的強烈影響。本公開描述了基于這種認識的方法，用于在3維中確定基因組的結構和確認(基因組的3D映射)。所公開的3D映射方法可以通過利用諸如例如Hi-C和其他染色體構象捕獲方法(ElzodeWitandWouterdeLaat.GenesDev.201226：11-24)和啟動子捕獲Hi-C(Schoenfelderetal.GenomeRes25：582-97(2015))等的技術來進行。還描述了利用通過3D映射協議獲得的信息的方法以及可以通過所述方法形成的哺乳動物細胞。本申請教導了如何生成多級3D基因組圖譜，并且然后使用該信息來鑒定用于表達異源基因的最佳基因組整合位點。例如，通過詢問映射的3D基因組結構，可以鑒定可能表現出高性能的整合位點。在一個實施例中，本公開涉及一種在高整合(HI)基因座處包含RTS的哺乳動物細胞。HI基因座是專利技術人通過分析基因組染色質的3D層次結構而鑒定的高性能基因組位點。有益的是，HI基因座處于基因組的穩定、轉錄活性環境中，并且可以重復靶向以遞送可預測和穩定水平的GOI表達。HI基因座可以位于可及染色質的活性基因組區室中，并且也可以位于拓撲相關結構域(TAD)邊界的約30,000個堿基對中。此外，HI基因座可以與基因組中與至少一個增強子元件相互作用的區域重疊。根據GOI的表達是由原位內源啟動子驅動還是由異源啟動子驅動，HI基因座可以不同。例如，在那些其中GOI的表達由原位內源啟動子驅動的細胞系中，HI基因座可以重疊并且位于轉錄起始位點(TSS)的下游。此外，在該實施例中，HI基因座可以與活性基因座重疊，并且在一些實施例中，也可以與完全標注的基因座重疊，例如，其表達產物或其缺乏對細胞不重要的活性基因。在那些其中GOI的表達由異源啟動子驅動的細胞系中，HI基因座通常可以在活性或非轉錄基因座的外部。例如，這種細胞中的HI基因座可以包含不與活性基因的任何相關啟動子區域重疊的基因座，或者在一個實施例中不在任何活性基因的約1,000個堿基對內(例如，在任何活性和完全標注的基因的約1,000個堿基對內)的基因座。在一些實施例中，細胞可以包含多個RTS，例如，在一些實施例中，至少兩個RTS，至少四個RTS，或者甚至更多。例如，細胞可以在單個HI基因座中、在不同的HI基因座中和/或在單獨的基因座(例如FerIL4基因座)中包含多個RTS。在一些實施例中，RTS可以包含Frt位點、lox位點、rox位點或att位點。在一些實施例中，RTS可以包含選自SEQIDNO.：126-155的序列。本文包含的細胞類型可以包含但不限于小鼠細胞、人細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、CHO-K1細胞、CHO-DXB11細胞、CHO-DG44細胞、包含所有變體的CHOK1SVTM細胞、包含所有變體的CHO谷氨酰胺合成酶敲除細胞、HEK細胞、包含貼壁和懸浮適應變體的HEK293細胞、HeLa細胞或HT1080細胞。在一個實施例中，細胞可以包含GOI，例如染色體整合的GOI，諸如報告基因、選擇基因、治療目的基因、輔助基因或基因的組合。GOI可以編碼難以表達的(DtE)蛋白，諸如Fc-融合蛋白、酶、膜受體或單克隆抗體(例如，雙特異性或三特異性單克隆抗體)。在一個實施例中，GOI可以位于單個HI基因座內的兩個RTS之間。在一些實施例中，細胞可以摻入多個GOI。例如，細胞可以在單個HI基因座內摻入兩個或更多個GOI，可以摻入多個GOI，其中一個或多個位于不同的HI基因座中，和/或可以在HI基因座和單獨的基因座的任何組合中摻入多個GOI。在一些實施例中，細胞可以摻入重組酶基因，例如位點特異性重組酶基因，其在一個實施例中可以染色體整合。還公開了用于生產重組細胞的方法。例如，一種方法可以包含映射細胞基因組的可及染色質中的峰，并且在可及染色質中的映射的峰內鑒定第一組峰，所述第一組峰位于可及染色質的活性基因組區室內，并且也位于拓撲相關結構域(TAD)邊界的約30,000個堿基對內。在一個實施例中，第一組峰可以在活性基因組區室中(例如，如由主成分分析方法(PCA)定義的)，并且也可以在開放染色質中(例如，如由ATAC-seq定義的)，但這不是方法的要求，并且在其他實施例本文檔來自技高網...

【技術保護點】
1.一種哺乳動物細胞，包括在第一高整合(HI)基因座處染色體整合的第一重組靶位點(RTS)，所述第一HI基因座位于可及染色質的活性基因組區室內和拓撲相關結構域(TAD)邊界的約30,000個堿基對內，所述第一HI基因座與所述細胞基因組中的與至少一個增強子元件相互作用的區域重疊。/n

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】20181001 US 62/739,5461.一種哺乳動物細胞，包括在第一高整合(HI)基因座處染色體整合的第一重組靶位點(RTS)，所述第一HI基因座位于可及染色質的活性基因組區室內和拓撲相關結構域(TAD)邊界的約30,000個堿基對內，所述第一HI基因座與所述細胞基因組中的與至少一個增強子元件相互作用的區域重疊。


2.根據權利要求1所述的細胞，其中所述第一HI基因座包括SEQIDNO：1-125中的一個，或者在SEQIDNO.：1-125中的任何一個的5′端或3′端的約5,000個堿基對內或與之重疊。


3.根據權利要求1所述的細胞，其中所述第一HI基因座與所述活性基因組區室中的轉錄起始位點(TSS)重疊。


4.根據權利要求3所述的細胞，其中所述TSS與活性基因可操作地連接，所述活性基因的表達或缺乏表達對于所述哺乳動物細胞是不重要的。


5.根據權利要求1所述的細胞，其中所述第一HI基因座不與基因座重疊。


6.根據權利要求1所述的細胞，其中所述第一HI基因座不與基因座的原位內源啟動子重疊。


7.根據權利要求6所述的細胞，其中所述第一HI基因座不在所述啟動子的約1,000個堿基對之內。


8.根據權利要求1所述的細胞，包括第二不同RTS。


9.根據權利要求8所述的細胞，其中所述第一不同RTS和所述第二不同RTS被染色體整合在所述第一HI基因座內。


10.根據權利要求8所述的細胞，其中所述第二不同RTS被染色體整合在第二HI基因座內。


11.根據權利要求8所述的細胞，其中所述第二不同RTS被染色體整合在單獨的基因座。


12.根據權利要求11所述的細胞，其中所述單獨的基因座是Fer1L4基因座。


13.根據權利要求1所述的細胞，包括多個附加的不同RTS。


14.根據權利要求1至13中任一項所述的細胞，其中所述RTS中的至少一個是frt位點、lox位點、rox位點或att位點。


15.根據權利要求1至14中任一項所述的細胞，其中所述RTS中的至少一個包括選自SEQIDNO.：126-155的序列。


16.根據權利要求1至15中任一項所述的細胞，其中所述哺乳動物細胞是小鼠細胞、人細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、CHO-K1細胞、CHO-DXB11細胞、CHO-DG44細胞、CHOK1SVTM或其變體、CHO谷氨酰胺合成酶敲除細胞或其變體、HEK細胞、HEK293細胞或其貼壁或懸浮適應變體、HeLa細胞或HT1080細胞。


17.根據權利要求1至16中任一項所述的細胞，進一步包括第一目的基因，其中所述第一目的基因是染色體整合的。


18.根據權利要求17所述的細胞，其中所述第一目的基因包括報告基因、選擇基因、治療目的基因、輔助基因或其組合。


19.根據權利要求18所述的細胞，其中所述治療目的基因包括編碼難以表達的蛋白的基因。


20.根據權利要求19所述的細胞，其中所述難以表達的蛋白選自由Fc-融合蛋白、酶、膜受體或單克隆抗體組成的組。


21.根據權利要求17至20中任一項所述的細胞，其中所述第一目的基因位于兩個所述RTS之間。


22.根據權利要求17至21中任一項所述的細胞，其中所述第一目的基因位于所述第一HI基因座內。


23.根據權利要求1至22中任一項所述的細胞，進一步包括第二目的基因，其中所述第二目的基因是染色體整合的。


24.根據權利要求23所述的細胞，其中所述第二目的基因位于所述第一HI基因座內。


25.根據權利要求23所述的細胞，其中所述第一目的基因位于所述第一HI基因座內，并且所述第二目的基因位于第二HI基因座內或單獨的基因座內。


26.根據權利要求23至25中任一項所述的細胞，進一步包括第三目的基因，其中所述第三目的基因是染色體整合的。


27.根據權利要求26所述的細胞，其中所述第三目的基因位于所述第一HI基因座內或位于所述第二HI基因座內或者位于或位于所述單獨的基因座內。


28.根據權利要求27所述的細胞，其中
a.所述第一目的基因、所述第二目的基因和所述第三目的基因中的至少一個位于所述第一HI基因座內，并且
b.所述第一目的基因、所述第二目的基因和所述第三目的基因中的至少一個位于所述第二HI基因座內。


29.根據權利要求1至28中任一項所述的細胞，進一步包括位點特異性重組酶基因。


30.根據權利要求29所述的細胞，其中所述位點特異性重組酶基因是染色體整合的。


31.一種用于生產重組細胞的方法，包括：
a.映射細胞基因組的可及染色質中的峰；
b.在映射的峰中鑒定所述可及染色質的活性基因組區室中以及拓撲相關結構域(TAD)邊界的約30,000個堿基對中的第一組峰；
c.在所述第一組峰內定義第一高整合(HI)基因座，所述第一HI基因座與所述基因組中的與至少一個增強子元件相互作用的區域重疊；和
d.在所述第一HI基因座內插入第一重組靶位點(RTS)。


32.根據權利要求31所述的方法，其中所述第一HI基因座包括SEQIDNO.：1-...

【專利技術屬性】
技術研發人員：P·M·奧卡拉漢，S·貝萬，R·揚，P·法拉色，L·張，
申請(專利權)人：龍沙有限公司，巴布拉罕姆研究所，輝瑞大藥廠，
類型：發明
國別省市：瑞士;CH