生產目標蛋白質的宿主細胞制造技術

一種經改造的真核宿主細胞，以產生異源目標蛋白質(POI)，該真核宿主細胞經過基因修飾，以減少三種不同內源宿主細胞蛋白質(HCP)中至少一種的產生，以及它在生產POI的方法中的用途。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】生產目標蛋白質的宿主細胞
本專利技術涉及在真核宿主細胞中的蛋白質生產，該宿主細胞經改造，以減少宿主細胞培養物中的雜質。
技術介紹
真核細胞培養物中產生的蛋白質作為診斷劑和治療劑已變得越來越重要。基于此目的，需要對細胞進行改造和/或選擇，以產生異常高水平的目標的重組或異源的蛋白質。細胞培養條件的優化對于重組或異源的蛋白質的成功商業化生產很重要。從宿主細胞釋放的副產物作為宿主細胞蛋白質(HCP)，并在培養物中積累，給重組或異源蛋白質的純化帶來困難，或者可能對產品功效或患者安全性構成風險。除哺乳動物宿主細胞外，酵母和絲狀真菌通常被用作生物制藥的蛋白質、以及大宗化學品(bulkchemicals)的生產宿主。甲基營養型酵母(例如巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris))，因有效分泌異源蛋白質而聞名。巴斯德畢赤氏酵母已被重新分類為一個新的屬Komagataella，并分為三個物種：K.pastoris、K.phaffii和K.pseudopastoris。通常地，用于生物技術應用的菌株屬于兩個建議的物種，K.pastoris和K.phaffii。菌株GS115、X-33、CBS2612和CBS7435是K.phaffii，而蛋白酶缺陷型菌株的SMD系列(例如，SMD1168)被分類為K.pastoris，這是所有可用的巴斯德畢赤酵母菌株的參考菌株。(Mattanovichetal.2009,MicrobCellFact.8:29；Kurtzman2009,JIndMicrobiolBiotechnol.36(11):1435-8)。由多基因序列分析確定，Komagataella(畢赤酵母屬)畢赤酵母的生物技術菌株為Komagataellaphaffii。Mattanovich等人(MicrobialCellFactories2009,8:29doi:10.1186/1475-2859-8-29)描述了K.pastoris的DSMZ70382型菌株的基因組測序，并分析了其分泌蛋白質組和糖轉運蛋白。Huang等人(ApplMicrobiolBiotechnol.2011Apr；90(1):235-47.doi:10.1007/s00253-011-3118-5.Epub2011Feb9.)描述了甲醇誘導培養物中巴斯德畢赤酵母分泌蛋白質的蛋白質組學分析，識別在甲醇誘導的巴斯德畢赤酵母X-33發酵培養物中分泌或釋放到培養基中的蛋白質。Heiss等人(ApplMicrobiolBiotechnol.2013Feb；97(3):1241-9.doi:10.1007/s00253-012-4260-4.Epub2012Jul17)識別了一種細胞外蛋白質X1(Epx1)，將其作為巴斯德畢赤酵母的主要污染宿主細胞蛋白質，產生抗體Fab片段。研究發現EPX1通常不會上調，只有當處于不同的脅迫環境(stresssituation)時才會上調。產生了各自的缺失菌株(Δepx1)，并發現所述缺失菌株比野生型對細胞壁破壞劑(熒光增白劑和剛果紅)更敏感，這表明Epx1可能對細胞壁具有保護作用。在野生型和Δepx1菌株之間，沒有觀察到生長和產物形成的顯著差異。但是，我們發現Epx1p不是一種高豐度的蛋白質，在巴斯德畢赤酵母細胞培養物中的總的HCP不到約3％(mol/mol)。HCP是由生產過程中使用的細胞或生物產生或編碼的蛋白質，并且與預期產品無關。有些對于生長、存活和正常的細胞加工是必需的，而另一些則可能不是必需的。無論用途如何，或缺乏其用途，HCP在最終藥物中通常是不需要的。盡管通常以少量(ppm，以每毫克所需蛋白質的納克表示)，但工業上去除它們需要花費大量的努力和成本。需要開發適合于生產和/或純化異源和/或重組蛋白質的改良宿主細胞。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供宿主細胞，所述宿主細胞經過修飾后產生的重組或異源蛋白質具有更低水平的HCP雜質。本專利技術的另一個目的是提供一種在宿主細胞中產生重組或異源蛋白質的方法，其中降低了重組或異源蛋白質被HCP雜質污染的風險。該目的通過所要求保護的主題解決。根據本專利技術，提供了一種經改造以產生異源目標蛋白質(POI)的真核宿主細胞，對該細胞進行基因修飾，以減少至少一種內源性宿主細胞蛋白質(HCP)的產生，所述內源性宿主細胞蛋白質選自由第一HCP(HCP1)、第二HCP(HCP2)和第三HCP(HCP3)組成的組，其中a)如果宿主細胞是Komagataellaphaffii，則HCP1包含被識別為SEQIDNO:1的氨基酸序列，或者如果是其他物種，則其為宿主細胞內源的同源序列；b)如果宿主細胞是Komagataellaphaffii，則HCP2包含被識別為SEQIDNO:3的氨基酸序列，或者如果是其他物種，則其為宿主細胞內源的同源序列；以及c)如果宿主細胞是Komagataellaphaffii，則HCP3包含被識別為SEQIDNO:5的氨基酸序列，或者如果是其他物種，則其為宿主細胞內源的同源序列。根據一個特定方面，所述細胞被進一步基因修飾，以減少另外的HCP，即HCP4的產生，其中d)如果宿主細胞是Komagataellaphaffii，則HCP4包含被識別為SEQIDNO:7的氨基酸序列，或者如果是其他物種，則其為宿主細胞內源的同源序列。具體地，所述至少一種HCP包括HCP1、HCP2、HCP3中的任何一種、兩種或三種。另外，具體地，所述至少一種HCP包括HCP4。具體地，所述至少一種HCP是HCP1，可選地或附加地是HCP2和/或HCP3和/或HCP4。具體的實施方式涉及減少兩種或更多種HCP，包括HCP1。具體地，所述至少一種HCP包括HCP1以及HCP2、HCP3或HCP4中的任何一種、兩種或三種。仍然具體地，所述至少一種HCP是HCP2，可選地是HCP1和/或HCP3和/或HCP4。仍然具體地，所述至少一種HCP是HCP3，可選地是HCP1和/或HCP2和/或HCP4。具體的實施方式涉及減少兩種或更多種HCP，例如，HCP1和HCP2，或HCP1和HCP3，或HCP2和HCP3。具體的實施方式涉及減少兩種或更多種HCP，包括減少以下任一種：HCP1和HCP4，或HCP2和HCP4，或HCP3和HCP4。具體地，SEQIDNO:1、3、5和7，分別是K.phaffii的野生型(天然)內源序列。具體地，各自的同源序列是除K.phaffii之外的物種的序列，例如酵母或絲狀真菌細胞，優選地是Komagataella或畢赤酵母屬，或啤酒酵母(Saccharomyces)屬或任何甲基營養的酵母。根據一個具體的方面，所述宿主細胞是a)酵母細胞，該酵母細胞的屬選自由畢赤酵母屬、漢遜酵母屬(Hansenula)、Komagataella、啤酒酵母屬、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、假絲酵母屬(Candida)、Og本文檔來自技高網...

【技術保護點】
1.一種經改造以產生異源目標蛋白質(POI)的真核宿主細胞，對所述真核宿主細胞進行基因修飾，以減少至少一種內源宿主細胞蛋白質(HCP)的產生，所述內源宿主細胞蛋白質(HCP)選自由第一HCP(HCP1)、第二HCP(HCP2)和第三HCP(HCP3)組成的組，其中/na)如果宿主細胞是Komagataella phaffii，則HCP1包含被識別為SEQ ID NO:1的氨基酸序列，或者如果是其他物種，則其為宿主細胞內源的同源序列；/nb)如果宿主細胞是Komagataella phaffii，則HCP2包含被識別為SEQ ID NO:3的氨基酸序列，或者如果是其他物種，則其為宿主細胞內源的同源序列；以及/nc)如果宿主細胞是Komagataella phaffii，則HCP3包含被識別為SEQ ID NO:5的氨基酸序列，或者如果是其他物種，則其為宿主細胞內源的同源序列。/n

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】20180212 EP 18156329.71.一種經改造以產生異源目標蛋白質(POI)的真核宿主細胞，對所述真核宿主細胞進行基因修飾，以減少至少一種內源宿主細胞蛋白質(HCP)的產生，所述內源宿主細胞蛋白質(HCP)選自由第一HCP(HCP1)、第二HCP(HCP2)和第三HCP(HCP3)組成的組，其中
a)如果宿主細胞是Komagataellaphaffii，則HCP1包含被識別為SEQIDNO:1的氨基酸序列，或者如果是其他物種，則其為宿主細胞內源的同源序列；
b)如果宿主細胞是Komagataellaphaffii，則HCP2包含被識別為SEQIDNO:3的氨基酸序列，或者如果是其他物種，則其為宿主細胞內源的同源序列；以及
c)如果宿主細胞是Komagataellaphaffii，則HCP3包含被識別為SEQIDNO:5的氨基酸序列，或者如果是其他物種，則其為宿主細胞內源的同源序列。


2.根據權利要求1所述宿主細胞，其中所述至少一個HCP是HCP1，并且可選地，是HCP2和/或HCP3。


3.根據權利要求1或2所述宿主細胞，所述宿主細胞被進一步基因修飾，以減少另外的HCP的產生，所述HCP為HCP4，其中
a)如果宿主細胞是Komagataellaphaffii，則HCP4包含被識別為SEQIDNO:7的氨基酸序列，或者如果是其他物種，則其為宿主細胞內源的同源序列。


4.根據權利要求1-3中任一項所述宿主細胞，其中每一個同源序列的特征在于，與相應氨基酸序列具有至少50％的序列同一性。


5.根據權利要求1-4中任一項所述宿主細胞，其中通過宿主細胞基因組的一種或多種基因修飾，對宿主細胞進行基因修飾，所述基因修飾包括中斷、取代、缺失或敲除(i)一種或多種內源多核苷酸或其中一部分；或(ii)表達控制序列，優選地，其中所述表達控制序列選自由啟動子、核糖體結合位點、轉錄或翻譯起始和終止序列、增強子和激活子序列組成的組。


6.根據權利要求5所述宿主細胞，其中通過所述一種或多種基因修飾，敲除編碼所述至少一種HCP中的任一種的基因。


7.根據權利要求1至6中任一項所述宿主細胞，與未經所述修飾的宿主細胞相比，所述宿主細胞被基因修飾，以使得所述至少一種HCP中的任一種的量減少至少50％(mol/mol)，優選地，通過敲除編碼所述至少一種HCP中的任一種的基因。


8.根據權利要求1至7中任一項所述宿主細胞，所述宿主細胞包含表達盒，所述表達盒包含與編碼所述POI的核苷酸序列可操作地連接的一個或多個調控核酸序列，其中所述一個或多個可操作連接的序列與POI編碼序列不是天然地相關。


9.根據權利要求1至8中任一項所述宿主細胞，其中所述POI是肽或蛋白質，所述肽或蛋白質選自由抗原結合蛋白質、治療性蛋白質、酶、肽、蛋白質抗生素、毒素融合蛋白質、...

【專利技術屬性】
技術研發人員：K·克拉斯，J·格拉哈姆，S·霍斯維亞克，C·基齊亞克，
申請(專利權)人：龍沙有限公司，
類型：發明
國別省市：瑞士;CH