一種熱穩定核酸疫苗佐劑及其制備方法技術

本發明專利技術涉及一種熱穩定核酸疫苗佐劑及其制備方法，屬于疫苗佐劑制備技術領域，包括以下重量份原料：25.8

【技術實現步驟摘要】
一種熱穩定核酸疫苗佐劑及其制備方法


[0001]本專利技術屬于疫苗佐劑制備
，具體地，涉及一種熱穩定核酸疫苗佐劑及其制備方法。

技術介紹

[0002]核酸疫苗是將編碼某種抗原蛋白的外源基因(DNA或RNA)直接導入動物體細胞內，并通過宿主細胞的表達系統合成抗原蛋白，誘導宿主產生對該抗原蛋白的免疫應答，以達到預防和治療疾病的目的。
[0003]疫苗佐劑指與抗原同時或預先應用，能增強機體針對抗原的免疫應答能力，或改變免疫應答類型的物質，包括無機佐劑(如氫氧化鋁)、有機佐劑(如脂多糖、分枝桿菌)及合成佐劑穴如雙鏈多聚肌苷酸，胞苷酸眼。
[0004]核酸疫苗是一類需要精心管理的敏感產品，將其置于適當的溫度下進行保護和運輸極為重要，熱應激會降低疫苗的效價，或甚至會使其失去活性，無法激活免疫反應，存在巨大潛在風險，針對這一問題，提供一種熱穩定核酸疫苗佐劑及其制備方法是目前需要解決的技術問題。

技術實現思路

[0005]本專利技術的目的在于提供一種熱穩定核酸疫苗佐劑及其制備方法，以解決上述
技術介紹
中所提及的技術問題。
[0006]本專利技術的目的可以通過以下技術方案實現：
[0007]一種熱穩定核酸疫苗佐劑，包括以下重量份原料：25.8
?
31.2份油相、50
?
60份水相、3.5
?
4.6份改性微球和0.5
?
1.1份無機填料；
[0008]該熱穩定核酸疫苗佐劑由以下步驟制成：
[0009]將無機填料和水相混合，頻率40
?
60kHz下超聲分散后，加入油相和改性微球，繼續超聲處理20min，即得一種熱穩定核酸疫苗佐劑。
[0010]進一步地，所述改性微球由以下步驟制成：
[0011]步驟A1、將聚乙烯亞胺、乙腈和三乙胺加入圓底燒瓶中，搖蕩均勻，先后加入六氯環三磷腈的乙腈溶液和殼聚糖的醋酸溶液，密封瓶口，在40℃下超聲反應8h，超聲功率180W，頻率40Hz，然后于轉速1000
?
1500r/min條件下離心20
?
30min，沉淀依次用丙酮和無水乙醇洗滌2次，最后于
?
45℃下干燥24h，得到復合微球，以聚乙烯亞胺、殼聚糖和六氯環三磷腈為底物，制備了交聯型聚磷腈復合微球，具有較高的生物相容性和可降解性，并且N、P的六元雜環具有較高穩定性，具有一定的耐高溫性能；
[0012]步驟A2、將DMF置于三口燒瓶中，冰浴條件下，向三口燒瓶中滴加氯磺酸，邊滴加邊攪拌，反應體系溫度保持0
?
5℃，滴加結束后，室溫下攪拌至澄清，得到處理劑，將氯磺酸和DMF混合得到處理劑；
[0013]步驟A3、將復合微球和無水乙醇加入三口燒瓶中，超聲分散30min后，向三口燒瓶
中滴加處理劑，滴加結束后，在微波輻射條件下反應1min，反應結束后于4℃冰箱中沉淀30min后取出，用蒸餾水洗滌并加入濃度2mol/L的氫氧化鈉溶液調節pH值為7
?
8，過濾，濾餅于蒸餾水中透析72h后，冷凍干燥至恒重，得到改性微球，利用復合微球表面的氨基與氯磺酸發生取代反應，使聚合物微球表面接枝磺酸基團，提高復合微球的水溶性。
[0014]進一步地，步驟A1中聚乙烯亞胺、乙腈、三乙胺、六氯環三磷腈的乙腈溶液和殼聚糖的醋酸溶液的用量比為0.42
?
0.48g：80
?
90mL：4mL：10
?
15mL：20mL，其中六氯環三磷腈的乙腈溶液由六氯環三磷腈和乙腈按照0.1g：20mL混合而成，其中殼聚糖的醋酸溶液由殼聚糖和質量分數6
?
8％醋酸溶液按照0.1g：20mL混合而成。
[0015]進一步地，步驟A2中DMF和氯磺酸的體積比為5：1。
[0016]進一步地，步驟A3中復合微球、無水乙醇、處理劑的用量比為50mg：100mL：8.5
?
9.1mg。
[0017]進一步地，所述無機填料由以下步驟制成：
[0018]步驟B1、將三乙胺、十六烷基三甲基氯化銨和去離子水加入三口燒瓶中，頻率40
?
45kHz下超聲分散15min，升溫至60℃，轉速150r/min條件下攪拌反應1h，向三口燒瓶中滴加氯苯，滴加結束后攪拌20min，滴加正硅酸乙酯，保溫攪拌反應12h，反應結束后，轉速30000rpm離心處理10min，沉淀用無水乙醇洗滌3
?
5次，最后于600℃馬弗爐中煅燒8h，冷卻至室溫，得到介孔二氧化硅；
[0019]步驟B2、氮氣保護下，將介孔二氧化硅、2，3
?
環氧丙基三甲基氯化銨和二甲基亞砜加入三口燒瓶中，控制溫度50
?
60℃，攪拌反應10min，然后加入氫氧化鉀，之后升溫至180
?
185℃，，攪拌速度為120
?
150r/min，回流反應3
?
5h，反應結束后，離心，沉淀用去離子水洗滌3
?
5次，最后于80℃下干燥至恒重，得到無機填料。
[0020]進一步地，所述B1中三乙胺、十六烷基三甲基氯化銨、去離子水、氯苯和正硅酸乙酯的用量比為0.18g：2.7
?
3.3g：36
?
40mL：2.6
?
4.1mL：1mL。
[0021]進一步地，所述B2中介孔二氧化硅、2，3
?
環氧丙基三甲基氯化銨、二甲基亞砜和氫氧化鉀的用量比為0.5
?
0.8g：0.2
?
0.4g：25.8
?
26.4mL：0.5g。
[0022]進一步地，所述油相為生物相容性油脂和礦物油中的一種。
[0023]進一步地，所述水相包括純化水、注射用水、甘油水溶液、質量分數0.9％生理鹽水、磷酸鹽緩沖液、檸檬酸緩沖液或Tris緩沖液中的一種或多種按照任意比混合而成。
[0024]本專利技術的有益效果：
[0025]1)本專利技術以油相、水相、改性微球和無機填料為原料制備了一種熱穩定核酸疫苗佐劑，為乳液狀，其內部物質吸附抗原后，具有凹凸不平的表面，抗原可以被吸附在其縫隙中，從而起到保護抗原的作用，使抗原在一定溫度下可以對抗熱損傷，保持生物活性，此外乳液中的小粒徑顆粒會在油水界面產生較高的堆積效率，形成更加均一的顆粒膜，從而阻隔乳液之間的相互碰撞，保持核酸疫苗佐劑的狀態穩定。
[0026]2)本專利技術以聚乙烯亞胺、殼聚糖和六氯環三磷腈為底物，制備了交聯型聚磷腈復合微球，通過處理劑處理使復合微球表面接枝磺酸基團，提高聚合物微球的水溶性，復合微球具有較高的生物相容性和可降解性，含N、P的六元雜環具有較高的熱穩定性，殼聚糖具有良好的固有免疫和特異性免疫的刺激能力，并且能誘導黏膜免疫，對抗原有高效保護性，能增強抗原免疫原性，其巨大的分子量及復雜本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
1.一種熱穩定核酸疫苗佐劑，其特征在于，包括以下重量份原料：25.8
?
31.2份油相、50
?
60份水相、3.5
?
4.6份改性微球和0.5
?
1.1份無機填料；改性微球由以下步驟制成：步驟A1、將聚乙烯亞胺、乙腈和三乙胺混合，加入六氯環三磷腈的乙腈溶液和殼聚糖的醋酸溶液，密封，40℃下超聲反應8h，離心，洗滌，干燥，得到復合微球；步驟A2、將DMF置于三口燒瓶中，冰浴下，滴加氯磺酸，邊滴加邊攪拌，反應體系溫度保持0
?
5℃，滴加結束后，室溫下攪拌至澄清，得到處理劑；步驟A3、將復合微球和無水乙醇超聲分散后，滴加處理劑，微波輻射反應1min，于4℃冰箱中沉淀30min后取出，洗滌后加入氫氧化鈉溶液調節pH值為7
?
8，透析，冷凍干燥，得到改性微球。2.根據權利要求1所述的一種熱穩定核酸疫苗佐劑，其特征在于，步驟A1中六氯環三磷腈的乙腈溶液由六氯環三磷腈和乙腈按照0.1g：20mL混合而成，殼聚糖的醋酸溶液由殼聚糖和質量分數6
?
8％醋酸溶液按照0.1g：20mL混合而成。3.根據權利要求1所述的一種熱穩定核酸疫苗佐劑，其特征在于，步驟A2中DMF和氯磺酸的體積比為5：1。4.根據權利要求1所述的一種熱穩定核酸疫苗佐劑，其特征在于，步驟A3中復合微球、無水乙醇、處理劑的用量比為50mg：100mL：8.5
?
9.1mg。5.根據權利要求1所述的一種熱穩定核酸疫苗佐劑，其特征在于，所述無機填料由以下步驟制成：氮氣保...

【專利技術屬性】
技術研發人員：雍金貴，潘紅，劉宗文，劉倩，武新春，
申請(專利權)人：通用生物系統安徽有限公司，
類型：發明
國別省市：