通過微生物方法產(chǎn)生NMN及其衍生物技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)涉及使用經(jīng)遺傳修飾的細菌進行的煙酰胺單核苷酸(NMN)、煙酰胺核苷(NR)和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)的微生物產(chǎn)生。胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)的微生物產(chǎn)生。胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)的微生物產(chǎn)生。

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
【國外來華專利技術(shù)】通過微生物方法產(chǎn)生NMN及其衍生物
[0001]相關(guān)申請
[0002]本申請根據(jù)美國法典第35篇第119條(e)款要求2020年5月5日提交且題為“通過微生物方法產(chǎn)生NMN及其衍生物(PRODUCTION OF NMN AND ITS DERIVATIVES VIA MICROBIAL PROCESSES)”的美國臨時申請?zhí)?3/020052的權(quán)益，所述臨時申請的全部內(nèi)容以引用的方式并入本文。
專利

[0003]本專利技術(shù)的領(lǐng)域涉及通過微生物方法產(chǎn)生煙酰胺單核苷酸(NMN)及其衍生物，包括煙酰胺核苷(NR)和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)。
[0004]專利技術(shù)背景
[0005]近年來，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)已從簡單的代謝輔因子演變至醫(yī)療保健應(yīng)用中的治療劑地位(Katsyuba等人2020
–
NAD
+
homeostasis in health and disease.Nature Metabolism 2:9
?
31)。類似地，與NAD密切相關(guān)的兩種其他化合物，即煙酰胺單核苷酸(NMN)和煙酰胺核苷(NR)目前被認為是具有抗衰老和長壽應(yīng)用潛力的保健營養(yǎng)品。NMN和NR目前是使用化學(xué)方法在商業(yè)上產(chǎn)生的，并且需要開發(fā)生物工藝技術(shù)來以成本有效的方式在商業(yè)規(guī)模上制造這些化合物。
[0006]已發(fā)現(xiàn)細菌停滯棒狀桿菌(Corynebacterium stationis)(ATCC 6872和不同描述為產(chǎn)氨短桿菌(Brevibacterium ammoniagenes)、產(chǎn)氨棒狀桿菌(Corynebacterium ammoniagenes)和停滯短桿菌(Brevibacterium stationis))在限制性條件下生長時是NMN和相關(guān)化合物的多產(chǎn)生產(chǎn)者。典型限制條件包括缺錳、添加特定化學(xué)抑制劑以及使用特定的溫度敏感性突變體在高溫下培養(yǎng)。包括在這種應(yīng)激誘導(dǎo)的NMN微生物產(chǎn)生中的是煙酸單核苷酸(NAMN)，其是當(dāng)細胞在限制性條件下生長并喂食煙酸(NA)或煙酰胺(Nam)時與NMN相關(guān)的化合物。本領(lǐng)域仍然需要增加所產(chǎn)生的NMN的量同時最小化或消除副產(chǎn)物NAMN的形成的NMN產(chǎn)生方法。

技術(shù)實現(xiàn)思路

[0007]本專利技術(shù)通過提供對谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)的遺傳修飾來解決上述需要，所述遺傳修飾能夠產(chǎn)生煙酰胺單核苷酸(NMN)而不是煙酸單核苷酸(NAMN)，以及產(chǎn)生NMN衍生分子如NR和NAD。
[0008]本專利技術(shù)涉及具有能夠產(chǎn)生NMN及其衍生物NR和NAD的遺傳修飾的工程化宿主細胞。本專利技術(shù)中還提供了對微生物宿主細胞進行遺傳工程化的方法，所述微生物宿主細胞能夠選擇性地產(chǎn)生NMN或NR或NAD。根據(jù)本專利技術(shù)可用于產(chǎn)生NMN、NR和NAD的原料包括煙酰胺(Nam)和煙酸(NA)。在本專利技術(shù)的一個優(yōu)選的實施方案中，Nam用作產(chǎn)生NMN、NAR或NAD的原料。
[0009]根據(jù)本專利技術(shù)可用于產(chǎn)生NMN、NR和/或NAD的微生物宿主細胞包括但不限于易于遺傳修飾的微生物細胞，如細菌細胞、真菌細胞和酵母細胞。在本專利技術(shù)的一個方面，谷氨酸棒狀桿菌用作優(yōu)選的微生物宿主細胞。在本專利技術(shù)的一個優(yōu)選方面，可用于本專利技術(shù)的谷氨酸棒
狀桿菌細胞最初進行遺傳修飾以改變其限制修飾系統(tǒng)，以使其適合于其他遺傳修飾，所述其他遺傳修飾使得能夠使用這種細菌細胞使用Nam或NA原料產(chǎn)生NMN、NR和NAD。本專利技術(shù)的工程化宿主細胞(包括谷氨酸棒狀桿菌)可包含用于引入條件活性核糖核苷酸還原酶以阻斷細胞分裂和生物質(zhì)累積，而不影響蛋白質(zhì)合成和正常代謝活性的遺傳修飾，例如由NrdHIEJ操縱子編碼的核糖核苷酸還原酶。
[0010]在本專利技術(shù)的一個方面，適合用于產(chǎn)生NMN、NR和/或NAD的遺傳修飾包括但不限于引入表達最初不存在于所述微生物宿主細胞中的酶蛋白的外源基因，增加編碼酶蛋白的內(nèi)源基因的相對表達、從而引起相應(yīng)酶蛋白的活性增加，和/或降低或完全消除編碼酶蛋白的內(nèi)源基因的表達、從而引起相應(yīng)酶蛋白的活性降低或完全消除。
[0011]在本專利技術(shù)的一個方面，當(dāng)工程化微生物宿主細胞缺乏編碼能夠?qū)am轉(zhuǎn)化為NMN的酶的內(nèi)源基因時，將編碼煙酰胺磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶的外源基因nadV引入所述工程化微生物宿主細胞中。在本專利技術(shù)的一個示例性實施方案中，編碼煙酰胺磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶的nadV基因的來源包括但不限于嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)、紫色色桿菌(Chromobacterium violaceum)、耐輻射異常球菌(Deinococcus radiodurans)、集胞藻屬某種(Synechocystis sp.)PCC 6803、嗜二噁烷假諾卡氏菌(Pseudonocardia dioxanivorans)CB1190、奧奈達湖希瓦氏菌(Shewanella oneidensis)MR
?
1和青枯雷爾氏菌(Ralstonia solanacearum)GMI1000。在本專利技術(shù)的一個最優(yōu)選的方面，使用本領(lǐng)域眾所周知的一種或多種遺傳工程化技術(shù)，將來自前述微生物物種中的任一者的nadV基因分離并引入谷氨酸棒狀桿菌菌株中。在一個優(yōu)選的方面，將所述外源基因nadV在其轉(zhuǎn)移到所述工程化微生物宿主細胞之前進行密碼子優(yōu)化，以確保所述煙酰胺磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶在所述微生物宿主細胞中的最佳表達。所述谷氨酸棒狀桿菌細胞內(nèi)的外源基因可在諸如lacZ啟動子的誘導(dǎo)型啟動子下，并且可使用乳糖或IPTG進行誘導(dǎo)。
[0012]在本專利技術(shù)的另一個方面，將來自杜克雷嗜血桿菌(Haemophilus ducreyi)的NAMPT基因作為煙酰胺磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶活性的來源引入所述工程化微生物宿主細胞中。在此實施方案的另一個方面，在已經(jīng)具有編碼煙酰胺磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶的內(nèi)源基因的那些微生物宿主細胞中，這種酶的活性可通過引入外源nadV基因(任選地密碼子優(yōu)化并且從前一段落中列出的任何來源獲得)或來自杜克雷嗜血桿菌的任選密碼子優(yōu)化的NAMPT基因而進一步增強。
[0013]在本專利技術(shù)實施方案的另一個方面，選擇用于使用Nam作為原料產(chǎn)生NMN并具有編碼煙酰胺磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶的密碼子優(yōu)化的外源基因的微生物宿主細胞還包含額外的遺傳修飾以確保磷酸核糖基焦磷酸(PRPP也已知為5
?
磷酸
?
核糖1
?
二磷酸)在導(dǎo)致Nam轉(zhuǎn)化為NMN的酶促反應(yīng)中充當(dāng)共底物的可用性。所述額外的遺傳修飾包括引入編碼磷酸核糖基焦磷酸合成酶的外源基因如prsA或通過增加內(nèi)源prsA基因表達或改善由所述prsA基因編碼的磷酸核糖基焦磷酸合成酶PrsA的性能來改善所述內(nèi)源prsA基因的性能。在本專利技術(shù)的一個優(yōu)選方面，使用編碼抗反饋磷酸核糖基焦磷酸合成酶的prsA基因。
[0014]在本專利技術(shù)的另一個實施方案中，作為在從Nam產(chǎn)生NMN中保存充當(dāng)共底物的PRPP的一種方式，在所述細胞內(nèi)利用PRPP池的其他途徑被阻斷。在本專利技術(shù)的一方面，使pyr本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護點】

【技術(shù)特征摘要】
【國外來華專利技術(shù)】1.一種能夠從煙酰胺產(chǎn)生煙酰胺單核苷酸和/或煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的經(jīng)遺傳修飾的微生物細胞，所述細胞包含選自由cgl1364、cgl1977、cgl2835、iunH1、iunH2和iunH3組成的組的一種或多種內(nèi)源基因中的突變，其中所述一種或多種基因中的每一者均編碼酶核苷酶。2.如權(quán)利要求1所述的經(jīng)遺傳修飾的微生物細胞，其中所述突變是降低或消除核苷酶活性的缺失、移碼或點突變。3.如權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的經(jīng)遺傳修飾的微生物細胞，其中所述微生物細胞是谷氨酸棒狀桿菌。4.如權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的經(jīng)遺傳修飾的微生物細胞，其中所述微生物細胞是谷氨酸棒狀桿菌ATCC 13034。5.如權(quán)利要求1至4中任一項所述的經(jīng)遺傳修飾的微生物細胞，所述經(jīng)遺傳修飾的微生物細胞還包含pncA基因中的突變，其中所述突變導(dǎo)致能夠?qū)燉０访擋０烦蔁熕岬拿傅氖Щ罨蚧钚越档汀?.如權(quán)利要求5所述的經(jīng)遺傳修飾的微生物細胞，其中所述突變是所述pncA基因的缺失、移碼或點突變，從而降低或消除脫酰胺活性。7.如權(quán)利要求1至4中任一項所述的經(jīng)遺傳修飾的微生物細胞，所述經(jīng)遺傳修飾的微生物細胞還包含編碼能夠?qū)燉０忿D(zhuǎn)化為煙酰胺單核苷酸的煙酰胺磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶的外源基因nadV。8.如權(quán)利要求7所述的經(jīng)遺傳修飾的微生物細胞，其中所述外源基因nadV來自嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌。9.如權(quán)利要求8所述的經(jīng)遺傳修飾的微生物細胞，其中對來自嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌的所述基因nadV進行密碼子優(yōu)化以在谷氨酸棒狀桿菌中表達。10.如權(quán)利要求7所述的經(jīng)遺傳修飾的微生物細胞，其中所述外源基因nadV來自紫色色桿菌。11.如權(quán)利要求10所述的經(jīng)遺傳修飾的微生物細胞，其中對來自紫色色桿菌的所述基因nadV進行密碼子優(yōu)化以在谷氨酸棒狀桿菌中表達。12.如權(quán)利要求7所述的經(jīng)遺傳修飾的微生物細胞，所述經(jīng)遺傳修飾的微生物細胞還包含編碼磷酸核糖基焦磷酸合成酶的prsA基因變體或突變體。13.如權(quán)利要求12所述的經(jīng)遺傳修飾的微生物細胞，其中所述prsA基因變體或突變體是來自谷氨酸棒狀桿菌ATCC 13032的prsA基因的密碼子優(yōu)化的變體。14.如權(quán)利要求12所述的經(jīng)遺傳修飾的微生物細胞，其中所述prsA基因變體或突變體編碼磷酸核糖基焦磷酸合成酶的抗反饋突變體。15.如權(quán)利要求7所述的經(jīng)遺傳修飾的微生物細胞，其中所述微生物細胞還包含對內(nèi)源pyrE基因的遺傳修飾，從而導(dǎo)致磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶的表達降低或消除。16.如權(quán)利要求7所述的經(jīng)遺傳修飾的微生物細胞，所述經(jīng)遺傳修飾的微生物細胞還包含內(nèi)源ushA基因中的突變，從而導(dǎo)致能夠?qū)燉０穯魏塑账徂D(zhuǎn)化為煙酰胺核苷的嘌呤核苷酶的失活或活性降低。17.如權(quán)利要求7所述的經(jīng)遺傳修飾的微生物細胞，所述經(jīng)遺傳修飾的微生物細胞還包含編碼能夠?qū)燉０穯魏塑账徂D(zhuǎn)化為煙酸單核苷酸的酶煙酰胺核苷酸酰胺酶的內(nèi)源pncC
基因的遺傳修飾，從而導(dǎo)致失活或活性降低。...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：D，
申請(專利權(quán))人：康納根有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：