一種檢測(cè)NSCLC標(biāo)志物CYFRA21-1上轉(zhuǎn)換熒光測(cè)試試劑盒、制備方法和應(yīng)用技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種檢測(cè)NSCLC標(biāo)志物CYFRA 21

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
一種檢測(cè)NSCLC標(biāo)志物CYFRA 21
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1上轉(zhuǎn)換熒光測(cè)試試劑盒、制備方法和應(yīng)用


[0001]本專利技術(shù)涉及一種基于ATRP信號(hào)放大策略構(gòu)建的檢測(cè)NSCLC標(biāo)志物CYFRA21
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1上轉(zhuǎn)換熒光測(cè)試試劑盒、制備方法和應(yīng)用，屬于生物分析


技術(shù)介紹

[0002]肺癌是一種常見的呼吸系統(tǒng)惡性腫瘤，也是全球癌癥相關(guān)死亡的最主要原因。研究表明，到2025年我國(guó)每年因肺癌死亡人數(shù)預(yù)計(jì)可達(dá)100萬。肺癌病理分為小細(xì)胞肺癌(small cell lung cancer)和非小細(xì)胞肺癌(non
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small cell lung cancer)，其中非小細(xì)胞肺癌約占肺癌的85％。肺癌的早期診斷是提高肺癌患者生存率、改善預(yù)后的關(guān)鍵。血清標(biāo)志物在肺癌的早期診斷中具有重要意義。用于小細(xì)胞肺癌(SCLC)篩查、診療效果評(píng)估的標(biāo)志物主要有神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)、癌癥胚胎抗原(CEA)、鱗狀細(xì)胞癌抗原(SCC)等，而CYFRA21
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1(細(xì)胞角蛋白19可溶性片段)是非小細(xì)胞肺癌最有價(jià)值的血清腫瘤標(biāo)志物，尤其對(duì)鱗狀細(xì)胞癌患者的早期診斷、療效觀察、預(yù)后監(jiān)測(cè)有重要意義。因此，發(fā)展穩(wěn)定、高效的檢測(cè)CYFRA21
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1含量的方法，有望能夠提高肺癌潛在患者的早診率。
[0003]目前，傳統(tǒng)的檢測(cè)血清標(biāo)志物的方法有放射免疫分析法、酶聯(lián)免疫分析法、化學(xué)發(fā)光免疫分析法等，但由于成本高，操作復(fù)雜，靈敏度低，難以用于實(shí)際檢測(cè)。近年來，隨著生物醫(yī)學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，熒光標(biāo)記技術(shù)因其靈敏度高、操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn)，在生物檢測(cè)領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。傳統(tǒng)的熒光分子為下轉(zhuǎn)換發(fā)光，如熒光蛋白、量子點(diǎn)和有機(jī)熒光染料。然而，這些熒光分子常伴隨著重疊的激發(fā)和吸收光譜，導(dǎo)致在應(yīng)用過程中會(huì)有明顯的光漂白和光閃爍現(xiàn)象，不能很好的應(yīng)用于復(fù)雜樣本的分析。上轉(zhuǎn)換材料(UCNPs)作為一種新型的納米發(fā)光材料，具有和傳統(tǒng)染料不同的發(fā)光機(jī)制，屬于反斯托克斯發(fā)光。UCNPs具有優(yōu)異的光學(xué)性能，如光穩(wěn)定性好、生物毒性低、發(fā)光強(qiáng)度高、不易漂白，熒光壽命長(zhǎng)等，但基于傳統(tǒng)目標(biāo)
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信號(hào)1:1比例的方法限制了熒光生物探針的靈敏度和適用性。ATRP反應(yīng)是一種生物分子動(dòng)態(tài)增長(zhǎng)的過程，它利用聚合作用使信號(hào)分子在生物識(shí)別位點(diǎn)上聚集形成長(zhǎng)鏈聚合物，將單個(gè)生物分子識(shí)別過程通過鏈?zhǔn)缴L(zhǎng)方式擴(kuò)大數(shù)百倍，從而有效放大生物檢測(cè)信號(hào)。因此本專利技術(shù)采用了ATRP信號(hào)放大策略來提高熒光測(cè)試試劑盒的靈敏度。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

[0004]針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本專利技術(shù)的目的是提供一種基于ATRP信號(hào)放大策略構(gòu)建的檢測(cè)NSCLC標(biāo)志物CYFRA21
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1上轉(zhuǎn)換熒光測(cè)試試劑盒、制備方法和應(yīng)用，其操作簡(jiǎn)單，且信號(hào)得到成倍的放大，提高了檢測(cè)的靈敏度，同時(shí)具有良好的穩(wěn)定性、選擇性和和重現(xiàn)性。
[0005]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本專利技術(shù)的技術(shù)方案之一是：
[0006]一種基于ATRP信號(hào)放大策略構(gòu)建的檢測(cè)NSCLC標(biāo)志物CYFRA 21
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1上轉(zhuǎn)換熒光測(cè)試試劑盒，包括以下原料：羧基磁珠、UCNPs、Ab1、Ab2、BIBA、HEMA、CuBr2、ME6TREN、AA、BSA、NHS、EDC、PBS緩沖液。
[0007]進(jìn)一步，部分原料使用時(shí)需配制成溶液，其中，UCNPs溶液濃度為5mg/mL，Ab1溶液濃度為1μg/mL，Ab2溶液濃度為4μg/mL，BIBA溶液濃度為30mM，HEMA溶液濃度為60mM，CuBr2/ME6TREN溶液中CuBr2和ME6TREN濃度均為10mM，AA溶液的濃度為2mM，BSA溶液濃度為10mg/mL，NHS溶液濃度為50mM，EDC溶液濃度為200mM。
[0008]進(jìn)一步，所述UCNPs為NaYF4:Er,Yb。
[0009]本專利技術(shù)的技術(shù)方案之一是：一種檢測(cè)NSCLC標(biāo)志物CYFRA 21
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1的方法，包括以下步驟：
[0010](1)將BIBA活化之后，連接Ab2，制得Ab2?
BIBA；
[0011](2)將UCNPs活化之后，連接HEMA，制得UCNPs/HEMA；
[0012](3)活化羧基磁珠，之后連接Ab1，孵育；
[0013](4)封閉步驟(3)之后磁珠上未反應(yīng)活化位點(diǎn)；
[0014](5)添加待檢測(cè)樣品，孵育；
[0015](6)加入步驟(1)連接好的Ab2?
BIBA，孵育；
[0016](7)加入步驟(2)連接好的UCNPs/HEMA、CuBr2/ME6TREN溶液、AA溶液，孵育；
[0017](8)將步驟(7)清洗之后的磁珠，分散在PBS緩沖液中，測(cè)試發(fā)射光譜。
[0018]進(jìn)一步，具體方法為：
[0019](1)連接ATRP反應(yīng)的引發(fā)劑BIBA和Ab2[0020]①
量取250μL的BIBA溶液，加入NHS溶液和EDC溶液各250μL，放入搖床中振搖反應(yīng)過夜；
[0021]②
在上述步驟
①
溶液中加入250μL的Ab2溶液，放入搖床中振搖反應(yīng)2h，制得Ab2?
BIBA溶液；
[0022](2)連接UCNPs和單體HEMA
[0023]①
量取250μL的UCNPs溶液，加入NHS溶液和EDC溶液各250μL，放入搖床中振搖反應(yīng)過夜；
[0024]②
在上述步驟
①
溶液中加入250μL HEMA溶液，放入搖床中振搖反應(yīng)2h，制得UCNPs/HEMA溶液；
[0025](3)修飾Ab1[0026]①
量取20μL羧基磁珠溶液，加入PBS緩沖液，進(jìn)行清洗，磁力分離，去上清液，將洗好的磁珠分散在PBS緩沖液中，加入NHS溶液和EDC溶液各20μL，放入搖床中振搖反應(yīng)過夜；
[0027]②
步驟
①
的反應(yīng)液磁力分離，去上清液，加入PBS緩沖液清洗，洗好后分散在PBS緩沖液中，然后加入20μL Ab1溶液，放入搖床中振搖反應(yīng)1h；
[0028](4)封閉位點(diǎn)
[0029]將步驟(3)反應(yīng)液磁力分離，去上清液，加入PBS緩沖液清洗，洗好后分散在PBS緩沖液中，然后加入20μL BSA溶液，放入搖床中振搖反應(yīng)0.5h；
[0030](5)修飾目標(biāo)物
[0031]將封閉好的步驟(4)反應(yīng)液磁力分離，去上清液，加入PBS緩沖液清洗，洗好后分散在PBS緩沖液中，加入20μL待檢測(cè)溶液，放入搖床中振搖反應(yīng)1h；
[0032](6)修飾Ab2[0033]將步驟(5)反應(yīng)液磁力分離，去上清液，加入PBS緩沖液清洗，洗好后分散在PBS緩
沖液中，加入步驟(1)連接好的Ab2?
BIBA溶液20μL，放入搖床中振搖反應(yīng)1h；
[0034](7)ATRP反應(yīng)
[0035]將步驟(6)反應(yīng)液磁力分離，去上清液，加入PBS緩沖液清本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】

【技術(shù)特征摘要】
1.一種基于ATRP信號(hào)放大策略構(gòu)建的檢測(cè)NSCLC標(biāo)志物CYFRA 21
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1上轉(zhuǎn)換熒光測(cè)試試劑盒，其特征在于，包括以下原料：羧基磁珠、UCNPs、Ab1、Ab2、BIBA、HEMA、CuBr2、ME6TREN、AA。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于ATRP信號(hào)放大策略構(gòu)建的檢測(cè)NSCLC標(biāo)志物CYFRA21
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1上轉(zhuǎn)換熒光測(cè)試試劑盒，其特征在于，還包括BSA、NHS、EDC、PBS緩沖液。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的基于ATRP信號(hào)放大策略構(gòu)建的檢測(cè)NSCLC標(biāo)志物CYFRA21
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1上轉(zhuǎn)換熒光測(cè)試試劑盒，其特征在于，部分原料使用時(shí)需配制成溶液，其中，UCNPs溶液濃度為5mg/mL，Ab1溶液濃度為1μg/mL，Ab2溶液濃度為4μg/mL，BIBA溶液濃度為30mM，HEMA溶液濃度為60mM，CuBr2/ME6TREN溶液中CuBr2和ME6TREN濃度均為10mM，AA溶液的濃度為2mM，BSA溶液濃度為10mg/mL，NHS溶液濃度為50mM，EDC溶液濃度為200mM。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于ATRP信號(hào)放大策略構(gòu)建的檢測(cè)NSCLC標(biāo)志物CYFRA21
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1上轉(zhuǎn)換熒光測(cè)試試劑盒，其特征在于，所述UCNPs為NaYF4:Er,Yb。5.一種檢測(cè)NSCLC標(biāo)志物CYFRA21
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1的方法，其特征在于，包括以下步驟：(1)將BIBA活化之后，連接Ab2，制得Ab2?
BIBA；(2)將UCNPs活化之后，連接HEMA，制得UCNPs/HEMA；(3)活化羧基磁珠，之后連接Ab1，孵育；(4)封閉步驟(3)之后磁珠上未反應(yīng)活化位點(diǎn)；(5)添加待檢測(cè)樣品，孵育；(6)加入步驟(1)連接好的Ab2?
BIBA，孵育；(7)加入步驟(2)連接好的UCNPs/HEMA、CuBr2/ME6TREN溶液、AA溶液，孵育；(8)將步驟(7)清洗之后的磁珠，分散在PBS緩沖液中，測(cè)試發(fā)射光譜。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測(cè)NSCLC標(biāo)志物CYFRA21
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1的方法，其特征在于，具體方法為：(1)連接ATRP反應(yīng)的引發(fā)劑BIBA和Ab2①
量取250μL的BIBA溶液，加入NHS溶液和EDC溶液各250μL，放入搖床中振搖反應(yīng)過夜；
②
在上述步驟
①
溶液中加入250μL的Ab2溶液，放入搖床中振搖反應(yīng)2h，制得Ab2?

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：楊懷霞，馬樂樂，劉艷菊，侯夢(mèng)園，高海洋，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：河南中醫(yī)藥大學(xué)，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：