一種具有抗EV71病毒功能的灰樹花低分子量多糖肽及其制備方法技術

本發明專利技術涉及一種具有抗EV71病毒功能的灰樹花低分子量多糖肽及其制備方法。所述制備方法具體為：將灰樹花子實體低溫烘干后粉碎成粗粉；向灰樹花子實體粗粉中加入70vol%乙醇醇提2次；向灰樹花70%乙醇提取物殘渣中加入純水提2次；水提濾液濃縮得到灰樹花水提物，再加入95%乙醇醇沉2次，收集上清液經濃縮、干燥得到灰樹花水提上清物；將灰樹花水提上清物依次使用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇進行萃取，再加入無水乙醇醇沉2次，收集醇沉物干燥后得到灰樹花低分子量多糖肽。經體外細胞實驗驗證，本發明專利技術制備的灰樹花低分子量多糖肽具有明顯的抗EV71病毒活性。EV71病毒活性。

【技術實現步驟摘要】
一種具有抗EV71病毒功能的灰樹花低分子量多糖肽及其制備方法


[0001]本專利技術屬于生物醫藥
，具體涉及一種具有抗EV71病毒功能的灰樹花低分子量多糖肽及其制備方法。

技術介紹

[0002]手足口病是嬰兒中常見的傳染病，腸道病毒71型（EV71）是主要病原體。近幾十年來，EV71主要威脅著公共衛生，嚴重加重了社會經濟的負擔。值得注意的是，這個病毒具有較強的傳染性，神經系統相關的并發癥比例特別高，有較高的重癥率和病死率。當前臨床上藥物治療效果有限，甚至長期服用容易造成肝損傷。而改善日常飲食行為，如增加富含生物活性的天然產物，將有助于抑制病毒入侵，提高機體免疫力。因此，尋找安全、有效、無毒的天然活性物質替代藥物是當務之急。
[0003]蘑菇是嬰幼兒重要的營養來源，具有顯著的健康特性。灰樹花是一種具有獨特的芳香味、營養豐富、口味鮮美的食藥用菌，因其顯著的保健功效和廣泛的生理藥理活性而受到廣大消費者的青睞。研究表明，灰樹花中含有多糖、甾體、多酚、生物堿、三萜、皂苷、有機酸、維生素、礦物質等功效成分，使得灰樹花具有抗腫瘤、增強免疫、抗病毒、降血糖及調節腸道菌群等生物活性。目前，對灰樹花多糖的研究主要集中在水提醇沉后的沉淀物多糖，而醇沉過程中產生的副產物上清液中還含有一定量的小分子多糖。大部分企業將上清液按照廢液進行處理，不僅浪費了優質的活性物質，還增加了生產成本。因此，灰樹花水提上清液的綜合利用具有重要意義。
[0004]現有技術提取的灰樹花多糖的分子量過大(>1000kDa)，粘度過高，不利于溶解和吸收。基于此，本專利技術提供了一種具有抗EV71病毒功能的灰樹花低分子量多糖肽及其制備方法，以期為灰樹花預防和治療嬰幼兒手足口病提供重要理論依據，并促進灰樹花的高值化應用開發。

技術實現思路

[0005]本專利技術的目的是提供一種具有抗EV71病毒功能的灰樹花低分子量多糖肽及其制備方法。
[0006]為了實現上述目的，本專利技術采用如下技術方案：本專利技術首先提供了一種具有抗EV71病毒功能的灰樹花低分子量多糖肽的制備方法，包括以下步驟：（1）將灰樹花子實體干燥后粉碎，備用；（2）向灰樹花粗粉中加入70vol%乙醇超聲提取1h，提取結束后過濾，得到超聲一次提取液和超聲一次濾渣；向超聲一次濾渣中加入70vol%乙醇超聲提取1h，提取結束后過濾，得到超聲二次提取液和超聲二次濾渣；將超聲二次濾渣于烘箱中干燥；（3）向烘干后的超聲二次濾渣中加入純水超聲提取1h，提取結束后過濾，得到超聲
三次提取液和超聲三次濾渣；向超聲三次濾渣中加入純水超聲提取1h，提取結束后過濾，得到超聲四次提取液和超聲四次濾渣；將超聲三次提取液和超聲四次提取液合并后進行旋轉蒸發濃縮，得到灰樹花水提物；（4）向灰樹花水提物中加入95vol%乙醇進行第一醇沉，醇沉結束后離心分離得到醇沉一次上清液和醇沉一次沉淀；將醇沉一次沉淀溶解于純水，再加入95vol%乙醇進行第二醇沉，醇沉結束后離心分離后得到醇沉二次上清液和醇沉二次沉淀；將醇沉二次上清液減壓濃縮，得到灰樹花水提上清液；（5）將灰樹花水提上清液依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇進行萃取，萃取完成后，將有機溶劑蒸干，向萃后剩余的水相中加入無水乙醇進行第三醇沉，醇沉結束后離心分離得到醇沉三次上清液和醇沉三次沉淀；在醇沉三次上清液中加入無水乙醇進行第四醇沉，醇沉結束后離心分離得到醇沉四次上清液和醇沉四次沉淀；將醇沉三次沉淀和四次沉淀混合后進行真空冷凍干燥，即得到所述灰樹花低分子量多糖肽。
[0007]進一步的，上述步驟（2）中，所述超聲的工藝條件為：超聲處理溫度50℃，超聲功率400W，超聲頻率45KHz。
[0008]進一步的，上述步驟（3）中，所述超聲的工藝條件為：超聲處理溫度80℃，超聲功率400W，超聲頻率45KHz。
[0009] 進一步的，上述步驟（3）中，所述灰樹花水提物的比重為0.1 g/cm3。
[0010]進一步的，上述步驟（4）中，所述醇沉的工藝條件為：醇沉溫度4℃，沉淀時間12~24h。
[0011] 進一步的，上述步驟（4）中，所述灰樹花水提上清液的比重為0.1 g/cm3。
[0012]進一步的，上述步驟（5）中，所述醇沉的工藝條件為：醇沉溫度4℃，沉淀時間12~24h。
[0013]進一步的，上述步驟（5）中，所述真空冷凍干燥的工藝條件為：預凍溫度
?
50℃，預凍時間為8小時，升華溫度為30℃，解析溫度為45℃，真空度為0.1MPa，真空冷凍干燥時間為36小時。
[0014]本專利技術還提供了一種利用上述制備方法得到的灰樹花低分子量多糖肽。
[0015]本專利技術還提供了上述一種灰樹花低分子量多糖肽在制備抗EV71病毒藥物中的應用。
[0016]本專利技術的有益效果在于：（1）本專利技術提供了一種具有抗EV71病毒功能的灰樹花低分子量多糖肽及其制備方法，對灰樹花醇提后的殘渣進行水提綜合利用，醇沉得到多糖后產生的副產物上清液進行分離純化，從而得到水溶性好的低分子量多糖肽，該制備方法成本低、活性高、綜合利用原料、且可以大規模生產。
[0017]（2）本專利技術制備得到的灰樹花低分子量多糖肽具有抗EV71病毒作用。濃度為25μg/mL時，灰樹花低分子量多糖肽具有顯著抗EV71病毒活性（P＜0.05）。濃度為50
?
200 μg/mL時，灰樹花低分子量多糖肽具有極顯著抗EV71病毒活性（P＜0.01）。并且在濃度50
?
200 μg/mL之間，對EV71病毒的抑制作用顯著高于陽性藥物利巴韋林（P＜0.05）。以期為灰樹花水提上清液的活性研究提供試驗基礎，也為提高灰樹花的商業價值提供理論支持。
附圖說明
[0018]圖1為灰樹花低分子量多糖肽的制備工藝流程圖。
[0019]圖2為灰樹花低分子量多糖肽的分子量分布圖。
[0020]圖3為單糖標品出峰時間圖（A）；灰樹花低分子量多糖肽的單糖組成出峰時間圖（B）。
[0021]圖4為灰樹花低分子量多糖肽對Vero細胞的增殖的影響；與正常組相比，*代表P＜0.05，**代表P＜0.01。
[0022]圖5制備得到的灰樹花低分子量多糖肽的抗EV71病毒活性；與正常組相比，*代表P＜0.05，**代表P＜0.01；與模型組相比，#代表P＜0.05，##代表P＜0.01；與陽性藥物組相比，
△
代表P＜0.05，
△△
代表P＜0.01。
具體實施方式
[0023]為進一步公開而不是限制本專利技術，以下結合實施例對本專利技術作進一步的詳細說明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試劑材料等，如無特殊說明，均為市售購買產品。
[0024]實施例1本專利技術所述一種具有抗EV71病毒功能的灰樹花低分子量多糖肽的制備方法其工藝流程如圖1所示，所述制備方法具體包括以下步驟：（1）將灰樹花子實體于50℃烘箱中干燥6 h后粉本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
1.一種具有抗EV71病毒功能的灰樹花低分子量多糖肽的制備方法，其特征在于：包括以下步驟：（1）將灰樹花子實體干燥后粉碎，備用；（2）向灰樹花粗粉中加入70vol%乙醇超聲提取1h，提取結束后過濾，得到超聲一次提取液和超聲一次濾渣；向超聲一次濾渣中加入70vol%乙醇超聲提取1h，提取結束后過濾，得到超聲二次提取液和超聲二次濾渣；將超聲二次濾渣于烘箱中干燥；（3）向烘干后的超聲二次濾渣中加入純水超聲提取1h，提取結束后過濾，得到超聲三次提取液和超聲三次濾渣；向超聲三次濾渣中加入純水超聲提取1h，提取結束后過濾，得到超聲四次提取液和超聲四次濾渣；將超聲三次提取液和超聲四次提取液合并后進行旋轉蒸發濃縮，得到灰樹花水提物；（4）向灰樹花水提物中加入95vol%乙醇進行第一醇沉，醇沉結束后離心分離得到醇沉一次上清液和醇沉一次沉淀；將醇沉一次沉淀溶解于純水，再加入95vol%乙醇進行第二醇沉，醇沉結束后離心分離后得到醇沉二次上清液和醇沉二次沉淀；將醇沉二次上清液減壓濃縮，得到灰樹花水提上清液；（5）將灰樹花水提上清液依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇進行萃取，萃取完成后，將有機溶劑蒸干，向萃后剩余的水相中加入無水乙醇進行第三醇沉，醇沉結束后離心分離得到醇沉三次上清液和醇沉三次沉淀；在醇沉三次上清液中加入無水乙醇進行第四醇沉，醇沉結束后離心分離得到醇沉四次上清液和醇沉四次沉淀；將醇沉三次沉淀和四...

【專利技術屬性】
技術研發人員：劉斌，熊雯宇，何君強，曾峰，林震山，彭培植，
申請(專利權)人：福建農林大學，
類型：發明
國別省市：