一種海藻糖合酶突變體及其制備和應(yīng)用制造技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)屬于基因工程和酶工程技術(shù)領(lǐng)域，公開了一種海藻糖合酶突變體,該海藻糖合酶突變體是將海藻糖合酶親本第160、192、216、228或234位氨基酸中的一個(gè)進(jìn)行點(diǎn)突變得到的；具體是通過設(shè)計(jì)定點(diǎn)突變的突變引物，以攜帶海藻糖合酶基因的載體為模板進(jìn)行定點(diǎn)突變并構(gòu)建含突變體的質(zhì)粒載體，然后轉(zhuǎn)化進(jìn)宿主細(xì)胞得到；該海藻糖合酶突變體應(yīng)用于海藻糖的生產(chǎn)。本發(fā)明專利技術(shù)海藻糖合酶突變體含有熱穩(wěn)定性提高的海藻糖合酶，用于生產(chǎn)海藻糖具有很好的工業(yè)化前景。景。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
一種海藻糖合酶突變體及其制備和應(yīng)用


[0001]本專利技術(shù)屬于基因工程和酶工程
，特別是涉及一種海藻糖合酶突變體及其制備和應(yīng)用。

技術(shù)介紹

[0002]海藻糖由兩個(gè)葡萄糖分子以α
?
1,1糖苷鍵連接而成，它是一種非還原性雙糖，甜度約為蔗糖的45％，素有“生命之糖”的美譽(yù)，廣泛存在于各種生物體中，包括細(xì)菌、酵母、真菌和藻類以及一些昆蟲、無脊椎動(dòng)物和植物中，尤其在酵母中含量較多，面包和啤酒等發(fā)酵食品及蝦類等也含有海藻糖。
[0003]海藻糖的無還原性、高度安全性、自身結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性以及它對(duì)生物膜、蛋白質(zhì)等生物大分子的非特異性保護(hù)作用，使海藻糖顯示出廣闊的應(yīng)用前景，越來越受到研究者的關(guān)注。美國FDA在2000年將海藻糖列為安全食品，隨后2001年歐洲European Regulation System也將海藻糖列為安全品，我國衛(wèi)生部在2005年正式批準(zhǔn)海藻糖為新資源食品。目前，海藻糖已經(jīng)被廣泛運(yùn)用于食品、化妝品和醫(yī)藥行業(yè)。
[0004]海藻糖生產(chǎn)方法有酵母提取法、雙酶法和單酶法。早期海藻糖是從酵母中提取的，這種工藝提取收率低，生產(chǎn)效率非常低下，導(dǎo)致海藻糖價(jià)格高達(dá)700美元/kg，目前該工藝路線已經(jīng)被淘汰。1995年日本林原生化株式會(huì)社專利技術(shù)了雙酶法(麥芽寡糖基海藻糖合成酶和麥芽寡糖基海藻糖水解酶)生產(chǎn)海藻糖，此工藝還需要添加普魯蘭酶和環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶，轉(zhuǎn)化溫度低，容易染菌，生產(chǎn)極其不穩(wěn)定。單酶法以麥芽糖為底物，利用海藻糖合酶一步轉(zhuǎn)化獲得海藻糖，此工藝可以連續(xù)轉(zhuǎn)化，工藝簡單。單酶法工藝存在以下問題：海藻糖合酶30
?
50℃條件下，轉(zhuǎn)化率高達(dá)71
?
80％，隨著轉(zhuǎn)化溫度的升高，轉(zhuǎn)化率呈下降趨勢(shì)，60℃條件下轉(zhuǎn)化率下降到66％。本行業(yè)技術(shù)人員可知，50℃以下酶轉(zhuǎn)化，容易染菌，導(dǎo)致生產(chǎn)不穩(wěn)定以及收率下降。因此對(duì)海藻糖合酶進(jìn)行分子生物學(xué)改造，提高其高溫條件下海藻糖的轉(zhuǎn)化率，有利于提高單酶法生產(chǎn)海藻糖的效率和穩(wěn)定性。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

[0005]本專利技術(shù)所要解決的技術(shù)第一個(gè)問題是：提供一種海藻糖合酶突變體，將海藻糖合酶親本第160、192、216、228或234位氨基酸中的一個(gè)進(jìn)行點(diǎn)突變得到的；
[0006]本專利技術(shù)所要解決的技術(shù)第二個(gè)問題是：提供一種海藻糖合酶突變體的制備方法，設(shè)計(jì)定點(diǎn)突變的突變引物，以攜帶海藻糖合酶基因的載體為模板進(jìn)行定點(diǎn)突變并構(gòu)建含突變體的質(zhì)粒載體，然后轉(zhuǎn)化進(jìn)宿主細(xì)胞得到；
[0007]本專利技術(shù)所要解決的技術(shù)第三個(gè)問題是：提供一種海藻糖合酶突變體在海藻糖生產(chǎn)中的應(yīng)用。
[0008]為解決上述技術(shù)問題，本專利技術(shù)具體的技術(shù)方案是：
[0009]一種海藻糖合酶突變體，是將氨基酸序列為序列表SEQ NO.1(NCBI登錄號(hào)為BAA19934.1)的海藻糖合酶分別在第160、192、216、228或234位氨基酸中進(jìn)行一個(gè)點(diǎn)突變得
到的；其中，突變體R160L為第160位氨基酸由精氨酸(Arg)變成異亮氨酸(Leu)，突變體D192A為第192位氨基酸由天冬氨酸(Asp)變成丙氨酸(Ala)，突變體T216N為第216位氨基酸由蘇氨酸(Thr)變成天門冬酰胺(Asn)，突變體E228V為第228位氨基酸由谷氨酸(Glu)變成纈氨酸(Val)，突變體G234D為第234位氨基酸由谷氨酸(Gla)變成天冬氨酸(Asp)。
[0010]一種海藻糖合酶突變體制備方法，包括以下步驟：
[0011]a.在海藻糖合酶親本氨基酸序列(NCBI登錄號(hào)為BAA19934.1)的基礎(chǔ)上確定第160、192、216、228或234位氨基酸為突變位點(diǎn)，并設(shè)計(jì)定點(diǎn)突變的突變引物：
[0012]引入R160L突變的定點(diǎn)突變引物為：
[0013]正向引物：5
’?
AGGCCTACTACTGGCACCTCTTCTACTGGCA
?3’
(下劃線為突變堿基)
[0014]反向引物：5
’?
GGCTGGTGCCAGTAGAAGAGGCGGTGCCAGT
?3’
(下劃線為突變堿基)；
[0015]引入D192A突變的定點(diǎn)突變引物為：
[0016]正向引物：5
’?
GGGCCGACCTGGGGGTGGCCGGCTTCCGCCT
?3’
(下劃線為突變堿基)
[0017]反向引物：5
’?
GCGTCCAGGCGGAAGCCGGCCACCCCCAGGT
?3’
(下劃線為突變堿基)；
[0018]引入T216N突變的定點(diǎn)突變引物為：
[0019]正向引物：5
’?
GCGAGAACCTCCCCGAGAACATTGAGGCGGT
?3’
(下劃線為突變堿基)
[0020]反向引物：5
’?
CGCTTCACCGCCTCAATGTTCTCGGGGAGGT
?3’
(下劃線為突變堿基)；
[0021]引入E228V突變的定點(diǎn)突變引物為：
[0022]正向引物：5
’?
GCCTGAGGAAGGCCCTGGTGGAGCGCTACGG
?3’
(下劃線為突變堿基)
[0023]反向引物：5
’?
CCGGGGCCGTAGCGCTCCACCAGGGCCTTCC
?3’
(下劃線為突變堿基)；
[0024]引入G234D突變的定點(diǎn)突變引物為：
[0025]正向引物：5
’?
AGGAGCGCTACGGCCCCGTCAAGATCCTCCT
?3’
(下劃線為突變堿基)
[0026]反向引物：5
’?
TCGGCGAGGAGGATCTTGACGGGGCCGTAGC
?3’
(下劃線為突變堿基)；
[0027]b.以表達(dá)載體TreS/pET
?
24a(+)為模板，以步驟a的引物分別進(jìn)行的PCR擴(kuò)增，并將PCR產(chǎn)物經(jīng)DpnⅠ消化后分別轉(zhuǎn)入質(zhì)粒載體；
[0028]c.將步驟b得到的質(zhì)粒載體分別轉(zhuǎn)化進(jìn)宿主細(xì)胞，得到海藻糖合酶突變體，分別為突變體R160L、突變體D192A、突變體T216N、突變體E228V和突變體G234D。
[0029]優(yōu)選的，所述的步驟b中表達(dá)載體TreS/pET
?
24a(+)是含有海藻糖合酶基因的質(zhì)粒TreS/pMD18T和pET24a(+)質(zhì)粒分別進(jìn)行NdeI和EcoRI雙酶切，酶切產(chǎn)物割膠回收海藻糖合酶基因片段后，再用T4連接酶連接到切開的pET24a(+)質(zhì)粒上得到。
[0030]優(yōu)選的，所述的步驟b中的質(zhì)粒載體為PUC系列、PET系列或PGEX系列中的任意一種。
[0031]進(jìn)一步的，所述的步驟b中的質(zhì)粒載體為PET系列質(zhì)粒載體。
[003本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】

【技術(shù)特征摘要】
1.一種海藻糖合酶突變體，其特征在于，是將氨基酸序列為序列表SEQ NO.1的海藻糖合酶分別在第160、192、216、228或234位氨基酸中進(jìn)行一個(gè)點(diǎn)突變得到的；其中，突變體R160L為第160位氨基酸由精氨酸變成異亮氨酸，突變體D192A為第192位氨基酸由天冬氨酸變成丙氨酸，突變體T216N為第216位氨基酸由蘇氨酸變成天門冬酰胺，突變體E228V為第228位氨基酸由谷氨酸變成纈氨酸，突變體G234D為第234位氨基酸由谷氨酸變成天冬氨酸。2.如權(quán)利要求1所述的海藻糖合酶突變體制備方法，其特征在于：包括以下步驟：a.在序列表SEQ NO.1海藻糖合酶氨基酸序列的基礎(chǔ)上確定第160、192、216、228或234位氨基酸為突變位點(diǎn)，并設(shè)計(jì)定點(diǎn)突變的突變引物：引入R160L突變的定點(diǎn)突變引物為：正向引物：5
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AGGCCTACTACTGGCACCTCTTCTACTGGCA
?3’
(下劃線為突變堿基)反向引物：5
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GGCTGGTGCCAGTAGAAGAGGCGGTGCCAGT
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(下劃線為突變堿基)；引入D192A突變的定點(diǎn)突變引物為：正向引物：5
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GGGCCGACCTGGGGGTGGCCGGCTTCCGCCT
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(下劃線為突變堿基)反向引物：5
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GCGTCCAGGCGGAAGCCGGCCACCCCCAGGT
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(下劃線為突變堿基)；引入T216N突變的定點(diǎn)突變引物為：正向引物：5
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GCGAGAACCTCCCCGAGAACATTGAGGCGGT
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(下劃線為突變堿基)反向引物：5
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CGCTTCACCGCCTCAATGTTCTCGGGGAGGT
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(下劃線為突變堿基)；引入E228V突變的定點(diǎn)突變引物為：正向引物：5
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GCCTGAGGAAGGCCCTGGTGGAGCGCTACGG
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【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：劉偉杰，景棟，徐明，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：濰坊盛泰藥業(yè)有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：