一株變形假單胞菌vgrG基因回補菌株及其構建與應用制造技術

本發明專利技術公開了一株變形假單胞菌vgrG基因回補菌株及其構建與應用。所述菌株分類命名為Pseudomonas plecoglossicida C

【技術實現步驟摘要】
一株變形假單胞菌vgrG基因回補菌株及其構建與應用


[0001]本專利技術屬于微生物
，具體涉及一株變形假單胞菌vgrG基因回補菌株及其構建與應用。

技術介紹

[0002]變形假單胞菌(Pseudomonasplecoglossicida)是一種革蘭氏陰性菌，廣泛分布在海水中，是典型的條件致病菌，在多種海洋魚類中引發流行病，是大黃魚、香魚等海水經濟魚類“內臟白點病”的病原，具有較高的感染率和死亡率，給我國養殖業造成巨大的經濟損失。
[0003]細菌
Ⅵ
型分泌系統(T6SS)在霍亂弧菌和銅綠假單胞菌中首次被發現，且與細菌的致病性有關。T6SS可以將效應蛋白注和溶血素共調節蛋白(Hcp)共同作用，通過T6SS的轉移將效應物分泌到靶細胞中。由特定VgrG蛋白攜帶的C端結構域毒素(CTD)是目前鑒定出的兩種靶向真核細胞的效應蛋白之一。VgrG蛋白復合物形成的尖峰通過穿透膜攻擊靶細胞，幫助病原菌直接將致命毒素注射到目標細胞中。
[0004]本專利技術構建了一株變形假單胞菌vgrG基因回補菌株，將vgrG基因與pCM130/tac表達載體連接并電轉導入變形假單胞菌vgrG基因敲除菌株，利用pCM130/tac載體使vgrG基因重新表達，并用qpcr進行驗證。采用生長曲線，運動性，成膜，趨化，黏附等表型實驗，確定vgrG基因回補成功。利用本專利技術所構建的vgrG基因回補菌株，為準確研究vgrG基因對變形假單胞菌的生物學特性奠定基礎。

技術實現思路

[0005]本專利技術的主要目的是提供一株變形假單胞菌vgrG基因回補菌株及其構建與應用。
[0006]為實現上述目的，本專利技術采用如下技術方案：一株變形假單胞菌vgrG基因回補菌株，所述菌株分類命名為PseudomonasplecoglossicidaC
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vgrG，已于2022年10月20日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCCNO：M20221616，保藏地址為湖北省武漢市武昌區八一路299號。
[0007]一種構建上述的變形假單胞菌vgrG基因回補菌株的方法，包括如下步驟：步驟1：使用比較轉錄組學技術分析變形假單胞菌在斜帶石斑魚脾臟內的基因表達情況，發現vgrG基因高表達，鎖定vgrG基因為目標基因；步驟2：PCR擴增vgrG基因序列，純化回收PCR產物；將pCM130/tac載體用BsrGI和NsiI限制性內切酶進行酶切，將酶切后的pCM130/tac載體與純化的vgrG基因PCR產物進行連接，得到重組載體pCM130/tac
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vgrG；將重組載體pCM130/tac
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vgrG通過電擊轉化的方式導入變形假單胞菌vgrG基因敲除菌株感受態細胞，得到重組變形假單胞菌細胞；取重組變形假單胞菌細胞懸浮液涂布在含有四環素的LB固體平板上，篩選陽性克隆，PCR檢驗vgrG基因序列是否已經克隆到變形假單胞菌vgrG基因敲除菌株中，得到變形假單胞菌vgrG基因回補菌株；
步驟3：利用qRT
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PCR對變形假單胞菌vgrG基因回補菌株的vgrG基因表達量進行檢驗，進一步確定vgrG基因回補成功，得到最終的變形假單胞菌vgrG基因回補菌株；其中，所述變形假單胞菌vgrG基因敲除菌株分類命名為Pseudomonasplecoglossicida
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vgrG，已于2022年10月20日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCCNO：M20221618，保藏地址為湖北省武漢市武昌區八一路299號；其中，所述vgrG基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；其中，PCR擴增所述vgrG基因序列的引物為：正向引物：5'
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cggctcgtataatgtatgcatATGGATACTCTTACTTGTAGTTTCAGTAGTAGC
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3'，反向引物：5'
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gacggatggcctttttgtacaTCATAACAGCGGATTGAGCAGC
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3'；其中，所述qRT
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PCR的引物為：正向引物：5'
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GTGAGGCAAAAGCAACCC
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3'，反向引物：5'
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CACCGCCCAAGAACGAGA
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3'。
[0008]上述一株變形假單胞菌vgrG基因回補菌株的應用，為如下1)至3)中至少一種：1)制備預防和治療魚內臟白點病的制劑；2)研究變形假單胞菌致病機理；3)研究變形假單胞菌vgrG基因功能。
[0009]一種用于構建變形假單胞菌vgrG基因回補菌株的試劑盒，所述試劑盒包括SEQ IDNO.1
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5所示的核苷酸序列；所述構建變形假單胞菌vgrG基因回補菌株的出發菌株為保藏編號為CCTCCNO：M20221618的變形假單胞菌vgrG基因敲除菌株。
[0010]本專利技術的顯著優點在于：與野生株NZBD9相比，變形假單胞菌vgrG基因回補菌株的相對表達量顯著上調；變形假單胞菌vgrG基因回補菌株的生長能力、成膜能力、黏附能力、運動性與野生株相比無顯著差異，趨化能力約恢復到野生株的82％，說明vgrG基因回補成功，可以發揮正常的功能。
附圖說明
[0011]圖1：回補株C
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vgrG目的基因vgrG擴增條帶。
[0012]圖2：回補株C
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vgrG目的基因vgrG相對表達量。
[0013]圖3：回補株C
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vgrG生長速度和最終菌濃度。
[0014]圖4：回補株C
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vgrG的黏附能力。
[0015]圖5：回補株C
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vgrG的成膜能力。
[0016]圖6：回補株C
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vgrG的趨化能力。
[0017]圖7：回補株C
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vgrG的運動性。
[0018]圖8：顯微鏡下黏附的細菌細胞。
[0019]圖9：回補株C
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vgrG的菌落。
具體實施方式
[0020]為了使本專利技術所述的內容更加便于理解，下面結合具體實施方式對本專利技術所述的技術方案做進一步的說明，但是本專利技術不僅限于此。
[0021]本申請中，變形假單胞菌野生株NZBD9已公開于參考文獻(HuangL,ZhaoL,SuY,etal.GenomesequenceofPseudomonasplecoglossicidastrainNZBD9[J].Genome Announcements,2018,6(4):e01412
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17.)當中。
[0022]本申請中，變形假單胞菌vgrG基因敲除菌株是在變形假單胞菌野生株NZBD9的基礎上，運用融合PCR和同源重組技術敲除變形假單胞菌野生株NZBD9的SEQ ID NO.1所示的vg本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
1.一株變形假單胞菌vgrG基因回補菌株，其特征在于：所述菌株分類命名為Pseudomonas plecoglossicida C
?△?
vgrG，已于2022年10月20日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO：M 20221616，保藏地址為湖北省武漢市武昌區八一路299號。2.一種構建權利要求1所述的變形假單胞菌vgrG基因回補菌株的方法，其特征在于：包括如下步驟：步驟1：使用比較轉錄組學技術分析變形假單胞菌在斜帶石斑魚脾臟內的基因表達情況，發現vgrG基因高表達，鎖定vgrG基因為目標基因；步驟2：PCR擴增vgrG基因序列，純化回收PCR產物；將pCM130/tac載體用 BsrGI和NsiI限制性內切酶進行酶切，將酶切后的pCM130/tac載體與純化的vgrG基因PCR產物進行連接，得到重組載體pCM130/tac
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vgrG；將重組載體pCM130/tac
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vgrG通過電擊轉化的方式導入變形假單胞菌vgrG基因敲除菌株感受態細胞，得到重組變形假單胞菌細胞；取重組變形假單胞菌細胞懸浮液涂布在含有四環素的LB固體平板上，篩選陽性克隆，PCR檢驗vgrG基因序列是否已經克隆到變形假單胞菌vgrG基因敲除菌株中，得到變形假單胞菌vgrG基因回補菌株；步驟3：利用qRT
?
PCR對變形假單胞菌vgrG基因回補菌株的vgrG基因表達量進行檢驗，進一步確定vgrG基因回補成功，得到最終的變形假單胞菌vgrG基因回補菌株；其中，所述變形假單胞菌vgrG基因敲除菌株分類命名為Pseudomonas plecoglossicida
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vgrG...

【專利技術屬性】
技術研發人員：趙玲敏，楊豆，鄢慶枇，黃力行，覃映雪，
申請(專利權)人：集美大學，
類型：發明
國別省市：