苦參組織培養與快速繁殖方法技術

提供苦參組織培養與快速繁殖方法，以苦參莖尖、地上莖和地下莖為外植體進行組織培養，成功誘導出試管苗。將外植體接種在ＭＳ＋２，４－Ｄ０．２ｍｇ／Ｌ＋６－ＢＡ　０．８ｍｇ／Ｌ培養基上，誘導率高達１００％，有大量愈傷組織產生，顏色為淡綠色，生長較快；用ＭＳ＋ＩＢＡ０．１ｍｇ／Ｌ＋６－ＢＡ１．５ｍｇ／Ｌ誘導從生芽增殖及分化時，增殖系數可達７．３，芽分化系數達８．３倍；用１／２ＭＳ＋ＩＢＡ１．５ｍｇ／Ｌ或１／２ＭＳ＋ＮＡＡ１．０ｍｇ／Ｌ進行生根培養，生根率高達９５％，平均根數６條以上，在一定的溫度和濕度條件下培養，移栽成活率可達８７％以上。

【技術實現步驟摘要】

.-本專利技術屬于生物技術組織培養領域，具體地，涉及苦參的組織培養與 快速繁殖方法。 技術背景苦參0Sop/zora y av^ce似Ait.)為豆科槐屬落葉灌木，中國約有12 種,集中分布于北方沙漠地區。英文名稱Lighiyellow Sophora Root又稱苦 骨、苦槐、水槐、地槐、野槐、白莖、虎麻、祿白、陵郎、川參等。根圓 柱形，外皮黃色。莖桿綠色，有稀疏細毛。葉互生，為奇數羽狀復葉，小 葉對生，長橢圓形，全緣先端尖或鈍，葉面綠色，背面蒼白色，總狀花序， 腋生或頂生，花蝶形，淡黃色。果實為莢果，內含黑色種子2 6枚，種 子含油為14.7%。莢長圓柱形，先端長，成熟后黑褐色，不開裂。種子1 5粒，淡褐色，長圓柱形，花期5 6月，果期7 9月。苦參是我國傳統中藥，《本草綱目》中既有記載:其藥用部分為根，具 有清熱、祛濕、殺蟲、利尿之功效。苦參的有效成分中研究較為成熟的是 生物堿及黃酮類化合物，生物堿(matrine)具有抗腫瘤、抗菌、抗病毒等 功效；黃酮提取物具有清熱、殺蟲、利尿、祛濕等作用。目前已經被開發 成各類藥物，用來治療癌癥、肝炎、急性炎癥等多種疾病；在農業上也有 廣泛的用途，對多種害蟲和病菌有抑制作用；苦參可以治各種牲畜病害， 也是畜牧業生產中綠色飼料的首選添加劑。此外，苦參又是良好的抗風沙、 耐鹽堿植物。苦參野生資源越來越少，而市場需求越來越大，人工種植以播種繁殖 為主，但種子發芽率低和遺傳分化問題嚴重。利用組織培養技術，不僅可 保留原有植株的優良性狀，而且將優良單株快速繁殖成無性系，可在生產 中推廣。迄今，現有技術中未見有苦參組織培養方面的報道。
技術實現思路
本專利技術旨在篩選和確定苦參組培快繁過程中影響愈傷組織、增殖分化 和生根的主要因素，提供成熟可靠的苦參組織培養方法，為解決資源短缺 提供一條可行的途徑。本專利技術的上述目的是通過下面的技術方案來實現的-苦參的組織培養方法，包括外植體消毒、誘導、繼代、生根培養，移載步驟，取苦參莖尖或地上莖或地下莖，洗凈，75。/。的酒精處理30s， 0.1% 升汞浸泡8min，再用無菌水清洗4 5次，晾干，切成每段0.5cm帶1 2 個芽，接入MS+2,4-D0.2mg/L+6-BA0.8mg/L中進行愈傷組織誘導，將愈 傷組織分割成3 5mm2的小段，插入MS+IBA0.1mg /L+6-BA1.5mg/L培養 基中，以每25d—個周期進行繼代培養，進行從生芽增殖及分化，然后將 高3cm的再生芽從芽簇上切下，接入生根培養基1/2MS+IBA1.5mg/L或 1/2MS+NAA1.0mg/L中，生根后的植株移栽到溫室1:1的腐殖土+蛭石中； 上述培養基中蔗糖質量濃度，除生根培養為15 g/L外，均為30g/L，瓊脂 質量濃度為8g/L，培養基pH5.8 6.2，配制好的培養基在1.05MPa 121°C 條件下滅菌20min;培養條件為溫度22 28'C ，每日光照時間10 12 h， 光照強度1500 3 000 Lx;在弱光500 1000Lx條件下誘導不定根。其中移載溫室腐殖土和蛭石在使用前先在12rC下高壓滅菌2h，移載 前7天，用1/2MS大量元素與清水隔日澆灌，移載7天后，改用清水澆灌， 移栽4周后在自然條件下常規管理。具體實施例方式下面用本專利技術的實施例來進一步說明本專利技術的實質性內容，但并不以 此來限定本專利技術。 實施例1: 苦參的組織培養 1材料與方法 1.1材料 l丄l試材初級培養時，選用苦參莖尖、地上莖和地下莖為外植體，研究培養基 和激素對苦參芽體增殖及分化的影響時，外植體均為無菌苗的莖尖或莖 段。l丄2試劑組成MS培養基的各成分、萘乙酸(NAA)、 6-芐基嘌呤(6-BA)、吲哚丁 酸(IBA)、 2,4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)、 2%NaC10、 0.P/。HgCl等。 1.2方法1.2.1外植體的消毒在自來水下沖洗30s，放在盛有適量水的燒杯里，用毛筆蘸肥皂并攪 拌，重復2次，然后用清水沖洗干凈。挑選出較嫩莖尖、地上莖和地下莖， 分別在無菌超凈工作臺上用三種方式滅菌..(1)2y。NaC10浸泡8min; (2) 0.1。/。HgCl浸泡8min; (3) 75%的酒精處理30s， 0.1%HgCl浸泡8min。以 上消毒過程每間隔30s輕搖一次，消毒完成后，使用無菌水清洗4 5次， 放到無菌濾紙上晾干，每段切約0.5cm (帶1 2個芽)，用于初代培養。1.2.2愈傷組織誘導采用易于誘導愈傷組織的MS培養基，探索生長素和細胞分裂素不同 配比對愈傷組織誘導的影響。本文選擇細胞分裂素6-BA，取量分別為0.5、 1.0、 2.0、 3.0mg/L;生長素2,4-D、 NAA和IBA，取量為0.2mg/L。設置對 照MSo,篩選出適宜的生長素和細胞分裂素組合，在進一步試驗出最適苦 參外植體愈傷組織誘導的組合用量配比。培養30d后，觀察愈傷組織生長 情況并統計誘導率。1.2.3從生芽增殖及分化將生長較好的愈傷組織分割成3 5mm2的小段，正向插于新的芽誘導 培養基中，以每25d —個周期進行繼代培養。采用MS培養基+6-BA+IBA， 為探索激素濃度對芽增殖和分化的影響，做了 3因素3水平正交實驗設計， 共9次處理(表2)。培養25d后，觀察外植體的生長情況并統計增殖系數 及芽分化率。本試驗繼代3次,每次轉代時間為培養后25天。1.2.4試管苗生根及移栽將高3cm左右的再生芽從芽簇上切下，接入生根培養基(1) 1/2MS+IBA， IBA取O、 1.0、 1,5、 2.0 mg/L， (2) 1/2MS+NAA， NAA取 1.0、 1.5、 2.0mg/L， 30d后統計生根率及生根芽的平均根數;生根之后的 完整小植株移栽到溫室腐殖土+蛭石(1: 1)上。1.2.5培養基及培養條件培養基中蔗糖質量濃度(除生根培養15 g/L外)均為30g/L，瓊脂質 量濃度為8g/L，培養基pH 5.8 6.2，配制好的培養基在1.05MPa(12rC) 條件下滅菌20min，滅菌后的培養基平放于工作臺上，冷卻備用。將接種 的培養材料放在培養室的培養架上培養。培養條件為溫度22 28'C ，每日光照時間10 12 h，光照強度1500 3 000 Lx;在弱光(500 1000Lx)條件下誘導不定根。試驗中所有處理都是每處理4次重復，每次重復4瓶， 每瓶5棵，即每個處理數為20。1.2.6數據分析以上試驗均采用單因子對比試驗(除外植體的消毒)，培養一定天數后統計并計算所需數據。采用DPS軟件進行回歸、差異顯著性等數據等分 析。2、結果與分析2.1不同消毒方法對外植體污染率的影響不同消毒劑和消毒方法對外植體污染率的影響很大，污染率6.1% 16.7%，處理1 3的污染率逐漸下降。從表1看出，第3種消毒方式的污染 率最低，為6.1%，可得出0.P/。HgCl消毒效果比2y。NaClO消毒效果好，多 種消毒劑結合使用，能夠更好地降低污染率。表1不同消毒方式對外植體污染率的影響 Tab 1. Different sterilization methods on the impact of explantscontamination ra本文檔來自技高網...

【技術保護點】
苦參的組織培養方法，包括外植體消毒、誘導、繼代、生根培養，移載步驟，取苦參莖尖或地上莖或地下莖，洗凈，７５％的酒精處理３０ｓ，０．１％升汞浸泡８ｍｉｎ，再用無菌水清洗４～５次，晾干，切成每段０．５ｃｍ帶１～２個芽，接入ＭＳ＋２，４－Ｄ　０．２ｍｇ／Ｌ＋６－ＢＡ　０．８ｍｇ／Ｌ中進行愈傷組織誘導，將愈傷組織分割成３～５ｍｍ↑［２］的小段，插入ＭＳ＋ＩＢＡ０．１ｍｇ／Ｌ＋６－ＢＡ１．５ｍｇ／Ｌ培養基中，以每２５ｄ一個周期進行繼代培養，進行從生芽增殖及分化，然后將高３ｃｍ的再生芽從芽簇上切下，接入生根培養基１／２ＭＳ＋ＩＢＡ１．５ｍｇ／Ｌ或１／２ＭＳ＋ＮＡＡ１．０ｍｇ／Ｌ中，生根后的植株移栽到溫室１∶１的腐殖土＋蛭石中；上述培養基中蔗糖質量濃度，除生根培養為１５ｇ／Ｌ外，均為３０ｇ／Ｌ，瓊脂質量濃度為８ｇ／Ｌ，培養基ｐＨ　５．８～６．２，配制好的培養基在１．０５ＭＰａ１２１℃條件下滅菌２０ｍｉｎ；培養條件為溫度２２～２８℃，每日光照時間１０～１２ｈ，光照強度１５００～３０００Ｌｘ；在弱光５００～１０００Ｌｘ條件下誘導不定根。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：黃家林，程愛華，嚴寧，胡虹，康志鈺，
申請(專利權)人：中國科學院昆明植物研究所，
類型：發明
國別省市：53[中國|云南]