【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及化合物生物技術及發酵工程技術生產領域，尤其是一種對香豆酸生產菌株及其構建方法與應用。
技術介紹
1、對香豆酸?(p-coumaric?acid)，又名對羥基肉桂酸，在植物中廣泛存在，是一種天然酚類化合物，具有抗氧化、抗炎和預防心血管疾病的作用，是很多重要化合物的前體。
2、目前對香豆酸合成方法主要為植物提取法、化學合成法、酶催化法和微生物發酵法。植物提取法具有生長周期長、收益率低、受環境影響大、提取成本高等缺點；化學合成法存在能耗高、副產物多、產率低、高污染等問題；酶催化法是由酪氨酸解氨酶作為關鍵酶催化酪氨酸底物生成對香豆酸，此方法對環境污染少，反應條件溫和，但在催化過程中需要添加酪氨酸底物，大大增加了生產成本；微生物發酵法是以葡萄糖作為微生物生長的能量來源，微生物從頭合成對香豆酸，無需添加底物，減少了生產成本，發酵過程條件溫和，具有工業化生產的潛力，然而現階段，對香豆酸的生物合成途徑中，尚無法通過大腸桿菌高產量從頭合成對香豆酸。
技術實現思路
1、本專利技術所要解決的技術問題在于提供一種對香豆酸生產菌株。
2、本專利技術所要解決的另一技術問題在于提供上述對香豆酸生產菌株的構建方法。
3、本專利技術所要解決的另一技術問題在于提供上述對香豆酸生產菌株的應用。
4、為解決上述技術問題，本專利技術的技術方案是：
5、一種對香豆酸生產菌株，為菌株zg08，是利用代謝工程手段在出發菌株 e.
6、在 e.coliw3110基因組上敲除 csra基因，使其不表達，
7、在 yeel假基因位點使用ptrc啟動子控制 tyrb基因過表達，
8、在 yciq假基因位點使用ptrc啟動子控制 tyra fbr基因過表達，
9、在 mbha假基因位點使用ptrc啟動子控制 aroe基因過表達，
10、在 ygay假基因位點使用ptrc啟動子控制 arog fbr基因過表達，
11、在 ycdn假基因位點使用ptrc啟動子控制 rgtal基因過表達，
12、在 rph假基因位點使用ptrc啟動子控制 t7?rnap基因過表達，
13、在petx02質粒上使用t7啟動子控制 rgtal基因過表達,
14、所述petx01質粒具有pet-28a(+)質粒載體部分特征，并在原質粒的基礎上敲除了 laci基因。
15、優選的，上述對香豆酸生產菌株，所述代謝工程手段為crispr-cas9基因編輯技術。
16、優選的，上述對香豆酸生產菌株，所述出發菌株 e.coliw3110的保藏號為atcc273250。
17、優選的，上述對香豆酸生產菌株，所述ptrc啟動子的核苷酸序列如序列表seq?idno.1所示。
18、優選的，上述對香豆酸生產菌株，所述 csra基因的核苷酸序列如序列表seq?idno.2所示。
19、優選的，上述對香豆酸生產菌株，所述 tyrb基因的核苷酸序列如序列表seq?idno.3所示。
20、優選的，上述對香豆酸生產菌株，所述 tyra fbr基因的核苷酸序列如序列表seq?idno.4所示。
21、優選的，上述對香豆酸生產菌株，所述 aroe基因的核苷酸序列如序列表seq?idno.5所示。
22、優選的，上述對香豆酸生產菌株，所述 arog fbr基因的核苷酸序列如序列表seq?idno.6所示。
23、優選的，上述對香豆酸生產菌株，所述 rgtal基因的核苷酸序列如序列表seq?idno.7所示。
24、優選的，上述對香豆酸生產菌株，所述t7?rnap基因的核苷酸序列如序列表seq?idno.8所示。
25、優選的，上述對香豆酸生產菌株，所述t7啟動子的核苷酸序列如序列表seq?idno.9所示。
26、優選的，上述對香豆酸生產菌株，所述petx01質粒的堿基序列如序列表seq?idno.10所示。
27、上述對香豆酸生產菌株的構建方法，在出發菌株 e.coliw3110基礎上進行定向改造，具體步驟如下：
28、（1）在出發菌株 e.coliw3110基因組上敲除 csra基因得到菌株zg01；
29、（2）以菌株zg01為出發菌株，在 yeel假基因位點使用ptrc啟動子控制 tyrb基因過表達得到菌株zg02；
30、（3）以菌株zg02為出發菌株，在 yciq假基因位點使用ptrc啟動子控制 tyra fbr基因過表達得到菌株zg03； ...
【技術保護點】
1.一種對香豆酸生產菌株，其特征在于：是利用代謝工程手段在出發菌株E.coliW3110的基礎上進行進一步改造獲得的，對csrA、tyrB、tyrAfbr、aroE、aroGfbr基因的表達強度進行調整，對T7?RNAP進行異源表達，對關鍵酶基因RgTal進行異源表達，構建表達RgTal基因的PETX02質粒，具體為：
2.根據權利要求1所述的對香豆酸生產菌株，其特征在于：所述出發菌株E.coliW3110的保藏號為ATCC?273250。
3.根據權利要求1所述的對香豆酸生產菌株，其特征在于：所述Ptrc啟動子的核苷酸序列如序列表SEQ?ID?NO.1所示；所述T7啟動子的核苷酸序列如序列表SEQ?ID?NO.9所示。
4.根據權利要求1所述的對香豆酸生產菌株，其特征在于：所述csrA基因的核苷酸序列如序列表SEQ?ID?NO.2所示；所述tyrB基因的核苷酸序列如序列表SEQ?ID?NO.3所示；所述tyrAfbr基因的核苷酸序列如序列表SEQ?ID?NO.4所示；所述aroE基因的核苷酸序列如序列表SEQ?ID?NO.5所示；所述aroG
5.根據權利要求1所述的對香豆酸生產菌株，其特征在于：所述PETX01質粒的堿基序列如序列表SEQ?ID?NO.10所示。
6.權利要求1-5之一所述對香豆酸生產菌株的構建方法，其特征在于：在出發菌株E.coliW3110基礎上進行定向改造，具體步驟如下：
7.權利要求1-5之一所述對香豆酸生產菌株在發酵生產對香豆酸方面的應用。
8.根據權利要求7所述對香豆酸生產菌株的應用，其特征在于：使用機械攪拌式發酵罐，具體步驟如下：
9.根據權利要求8所述對香豆酸生產菌株的應用，其特征在于：所述種子培養中采用的種子培養基：葡萄糖30g/L，酵母5g/L，蛋白胨3g/L，(NH4)2SO4?1g/L，KH2PO4?2g/L，MgSO4·7H2O?1g/L，檸檬酸3g/L，谷氨酸?3g/L，其余為水；所述發酵培養中采用的發酵培養基：葡萄糖15g/L，酵母粉6g/L，蛋白胨2g/L，檸檬酸?3g/L，(NH4)2SO41.5g/L，KH2PO44g/L，MgSO4·7H2O?2g/L，谷氨酸3g/L，MnSO4·H2O?10mg/L，FeSO4·7H2O?20mg/L，其余為水。
10.根據權利要求8所述對香豆酸生產菌株的應用，其特征在于：在進行發酵培養時，隨葡萄糖溶液流加PLP和氯化膽堿，每升80%葡萄糖溶液中添加9mgPLP與2.25g氯化膽堿。
...【技術特征摘要】
1.一種對香豆酸生產菌株，其特征在于：是利用代謝工程手段在出發菌株e.coliw3110的基礎上進行進一步改造獲得的，對csra、tyrb、tyrafbr、aroe、arogfbr基因的表達強度進行調整，對t7?rnap進行異源表達，對關鍵酶基因rgtal進行異源表達，構建表達rgtal基因的petx02質粒，具體為：
2.根據權利要求1所述的對香豆酸生產菌株，其特征在于：所述出發菌株e.coliw3110的保藏號為atcc?273250。
3.根據權利要求1所述的對香豆酸生產菌株，其特征在于：所述ptrc啟動子的核苷酸序列如序列表seq?id?no.1所示；所述t7啟動子的核苷酸序列如序列表seq?id?no.9所示。
4.根據權利要求1所述的對香豆酸生產菌株，其特征在于：所述csra基因的核苷酸序列如序列表seq?id?no.2所示；所述tyrb基因的核苷酸序列如序列表seq?id?no.3所示；所述tyrafbr基因的核苷酸序列如序列表seq?id?no.4所示；所述aroe基因的核苷酸序列如序列表seq?id?no.5所示；所述arogfbr基因的核苷酸序列如序列表seq?id?no.6所示；所述rgtal基因的核苷酸序列如序列表seq?id?no.7所示；所述t7?rnap基因的核苷酸序列如序列表seq?id?no.8所示。
5.根...
【專利技術屬性】
技術研發人員：徐慶陽，肖志剛，馬零，陳志超，
申請(專利權)人：天津科技大學，
類型：發明
國別省市：
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