【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及基因工程，特別涉及一種用于表達白蕓豆alpha-淀粉酶抑制蛋白的重組質粒、重組工程菌及其制備方法。
技術介紹
1、alpha-淀粉酶抑制蛋白，是一種重要的生物活性物質，在醫療健康領域具有顯著的應用價值。alpha-淀粉酶抑制蛋白通過抑制alpha-淀粉酶的活性，能夠減緩淀粉在口腔和小腸中的消化速率，從而降低食物的血糖生成指數（gi值），有助于控制血糖水平。這一特性使其成為糖尿病管理的有力工具，特別是對于那些需要控制餐后血糖波動的患者而言，alpha-淀粉酶抑制蛋白的作用更為重要。除了降血糖作用，alpha-淀粉酶抑制蛋白還具有減脂、改善靶細胞對胰島素的敏感性、減緩胃排空速率等多重益處，這使得它們在體重管理和糖尿病代謝綜合征的調節中具有潛在的應用前景。在食品工業中，alpha-淀粉酶抑制蛋白可作為功能性食品成分，幫助開發低gi食品，這對于糖尿病患者和健康意識高的消費者尤為重要。alpha-淀粉酶抑制蛋白可以減緩淀粉的消化，有助于延長飽腹感，從而在減肥和體重管理產品中發揮作用。此外，alpha-淀粉酶抑制蛋白在農業領域的應用也正在受到關注，例如用于提高作物的抗蟲性和改進作物儲藏穩定性。這些多方面的應用不僅展現了alpha-淀粉酶抑制蛋白在促進人類健康方面的潛力，也突顯了其在食品工業和農業技術中的多樣化應用?？偟膩碚f，alpha-淀粉酶抑制蛋白作為一種多功能生物活性物質，在醫療、食品及農業領域展現出廣泛的應用前景，alpha-淀粉酶抑制蛋白通過多種機制帶來的健康益處使其成為值得進一步研究和開發的目標。
2、研
3、因此，現有技術中使用浸提等物理方法從白蕓豆中提取alpha-淀粉酶抑制蛋白的方式，具有alpha-淀粉酶抑制蛋白產量較低的技術缺陷。
技術實現思路
1、本專利技術的目的在于提出一種用于表達白蕓豆alpha-淀粉酶抑制蛋白的重組質粒、重組工程菌及其制備方法，旨在解決現有技術中使用浸提等物理方法從白蕓豆中提取alpha-淀粉酶抑制蛋白的方式，具有alpha-淀粉酶抑制蛋白產量較低的技術缺陷。
2、為達此目的，本專利技術采用以下技術方案：
3、第一方面，本專利技術公開了一種用于表達白蕓豆alpha-淀粉酶抑制蛋白的重組質粒，包括：第一重組質粒和/或第二重組質粒；第一重組質粒含有第一白蕓豆alpha-淀粉酶抑制蛋白編碼基因；第二重組質粒含有第二白蕓豆alpha-淀粉酶抑制蛋白編碼基因。
4、所述第一白蕓豆alpha-淀粉酶抑制蛋白基因通過白蕓豆alpha-淀粉酶抑制蛋白基因經過第一密碼子優化得到，所述第一白蕓豆alpha-淀粉酶抑制蛋白基因序列如seq?idno.2所示。
5、所述第二白蕓豆alpha-淀粉酶抑制蛋白基因通過白蕓豆alpha-淀粉酶抑制蛋白基因經過第二密碼子優化得到，第二白蕓豆alpha-淀粉酶抑制蛋白基因序列如seq?idno.3所示。
6、白蕓豆alpha-淀粉酶抑制蛋白基因來源于白蕓豆提取物，白蕓豆alpha-淀粉酶抑制蛋白基因序列如seq?id?no.1所示。
7、第二方面，本專利技術公開了一種重組工程菌，包括：第一重組工程菌和/或第二工程菌；所述第一重組工程菌含有如上所述的第一重組質粒，所述第一重組工程菌包括如seqid?no.2所示的核苷酸序列；所述第二重組工程菌含有如上所述的第二重組質粒，所述第二重組工程菌包括如seq?id?no.3所示的核苷酸序列。
8、第三方面，本專利技術公開了一種用于表達白蕓豆alpha-淀粉酶抑制蛋白的重組工程菌的制備方法，包括：
9、s1.設計白蕓豆alpha-淀粉酶抑制蛋白基因特異性引物，并使用白蕓豆基因組cdna作為模板進行pcr反應；擴增后的產物經過凝膠電泳和dna測序進行驗證，得到白蕓豆alpha-淀粉酶抑制蛋白基因(pasi)；
10、s2.使用軟件工具對白蕓豆alpha-淀粉酶抑制蛋白基因(pasi)分別針對大腸桿菌表達系統進行第一密碼子優化得到第一白蕓豆alpha-淀粉酶抑制蛋白基因(pasi01)、針對枯草芽孢桿菌表達系統進行第二密碼子優化得到第二白蕓豆alpha-淀粉酶抑制蛋白基因(pasi02)；
11、s3.設計引物，在第一白蕓豆alpha-淀粉酶抑制蛋白基因(pasi01)和pet28a載體上引入第一酶切位點，在第二白蕓豆alpha-淀粉酶抑制蛋白基因(pasi02)和phy-p43載體上引入第二酶切位點；
12、s4.利用雙酶切法在第一酶切位點分別將第一白蕓豆alpha-淀粉酶抑制蛋白基因(pasi01)和pet28a載體打開；利用雙酶切法在第二酶切位點分別將第二白蕓豆alpha-淀粉酶抑制蛋白基因(pasi02)和phy-p43載體打開；
13、s5.用連接酶將打開的第一白蕓豆alpha-淀粉酶抑制蛋白基因(pasi01)與pet28a載體連接，構建第一重組質粒(pet28a-pasi01)，隨后使用熱激法將第一重組質粒轉化到表達載體escherichia?coli?rosetta(de3)之上；
14、s6.用連接酶將打開的第二白蕓豆alpha-淀粉酶抑制蛋白基因(pasi02)與phy-p43載體連接，構建出第二重組質粒(phy-p43-pasi02)，隨后使用電轉法將第二重組質粒轉化到表達載體bacillus?subtilis?wb800n之上；
15、s7.將s5及s6中培養的菌液稀釋后分別涂布在卡那霉素抗性培養基上，挑取陽性轉化子，分別得到第一重組工程菌(de3-pet28a-pasi01)、第二重組工程菌(wb800n-phy-p43-pasi02)；
16、s8.將第一重組工程菌(de3-pet28a-pasi01)、第二重組工程菌(wb800n-phy-p43-pasi02)分別接種于lb培養液中，搖菌擴繁至對數期時加入iptg誘導表達。
17、優選的，白蕓豆alpha-淀粉酶抑制蛋白基因(pasi)分別針對大腸桿菌表達系統進行第一密碼子優化，其中，密碼子偏好性參考大腸桿菌k12mg1655，將ccc、gg本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種用于表達白蕓豆Alpha-淀粉酶抑制蛋白的重組質粒，其特征在于，包括：第一重組質粒和/或第二重組質粒；
2.根據權利要求1所述用于表達白蕓豆Alpha-淀粉酶抑制蛋白的重組質粒，其特征在于，所述第一白蕓豆Alpha-淀粉酶抑制蛋白基因通過白蕓豆Alpha-淀粉酶抑制蛋白基因經過第一密碼子優化得到，所述第一白蕓豆Alpha-淀粉酶抑制蛋白基因序列如SEQ?ID?NO.2所示。
3.根據權利要求2所述用于表達白蕓豆Alpha-淀粉酶抑制蛋白的重組質粒，其特征在于，所述第二白蕓豆Alpha-淀粉酶抑制蛋白基因通過白蕓豆Alpha-淀粉酶抑制蛋白基因經過第二密碼子優化得到，第二白蕓豆Alpha-淀粉酶抑制蛋白基因序列如SEQ?ID?NO.3所示。
4.根據權利要求3所述用于表達白蕓豆Alpha-淀粉酶抑制蛋白的重組質粒，其特征在于，白蕓豆Alpha-淀粉酶抑制蛋白基因來源于白蕓豆提取物，白蕓豆Alpha-淀粉酶抑制蛋白基因序列如SEQ?ID?NO.1所示。
5.一種重組工程菌，其特征在于，包括：第一重組工程菌和/或第二工程菌；>
6.一種用于表達白蕓豆Alpha-淀粉酶抑制蛋白的重組工程菌的制備方法，其特征在于，包括：
7.根據權利要求6所述的制備方法，其特征在于，步驟S2中，白蕓豆Alpha-淀粉酶抑制蛋白基因分別針對大腸桿菌表達系統進行第一密碼子優化，其中，密碼子偏好性參考大腸桿菌K12MG1655，將CCC、GGG、GGA、AGG這幾個大腸桿菌稀有密碼子或低頻使用密碼子進行優化。
8.根據權利要求6所述的制備方法，其特征在于，步驟S2中，白蕓豆Alpha-淀粉酶抑制蛋白基因針對枯草芽孢桿菌表達系統進行第二密碼子優化，其中，密碼子偏好性參考Bacillus?subtilis進行優化。
9.根據權利要求6所述的制備方法，其特征在于，步驟S3中，第一酶切位點為BamHI和HindIII；第二酶切位點為BamHI和EcoRI。
10.根據權利要求6所述的制備方法，其特征在于，步驟S5及S6中，所述連接酶為T4?DNA連接酶。
...【技術特征摘要】
1.一種用于表達白蕓豆alpha-淀粉酶抑制蛋白的重組質粒，其特征在于，包括：第一重組質粒和/或第二重組質粒；
2.根據權利要求1所述用于表達白蕓豆alpha-淀粉酶抑制蛋白的重組質粒，其特征在于，所述第一白蕓豆alpha-淀粉酶抑制蛋白基因通過白蕓豆alpha-淀粉酶抑制蛋白基因經過第一密碼子優化得到，所述第一白蕓豆alpha-淀粉酶抑制蛋白基因序列如seq?id?no.2所示。
3.根據權利要求2所述用于表達白蕓豆alpha-淀粉酶抑制蛋白的重組質粒，其特征在于，所述第二白蕓豆alpha-淀粉酶抑制蛋白基因通過白蕓豆alpha-淀粉酶抑制蛋白基因經過第二密碼子優化得到，第二白蕓豆alpha-淀粉酶抑制蛋白基因序列如seq?id?no.3所示。
4.根據權利要求3所述用于表達白蕓豆alpha-淀粉酶抑制蛋白的重組質粒，其特征在于，白蕓豆alpha-淀粉酶抑制蛋白基因來源于白蕓豆提取物，白蕓豆alpha-淀粉酶抑制蛋白基因序列如seq?id?no.1所示。
5.一種重組...
【專利技術屬性】
技術研發人員：王文昭，廖家龍，龍俊儒，林佳純，袁越，黃強，高楚涵，
申請(專利權)人：福瑞萊環保科技深圳股份有限公司，
類型：發明
國別省市：
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