【技術實現步驟摘要】
本申請涉及蛋白質或多肽領域，具體地涉及膠原蛋白、其制備方法和用途。
技術介紹
1、膠原蛋白是廣泛分布于人體結締組織的一類蛋白質，也是人體含量最多的蛋白質，可以占到蛋白質總量的25％～35％。它的主要功能體現在維護細胞外環境，維持組織器官的正常生理功能，修復肌體損傷等方面。膠原蛋白是天然的生物資源，具有其它高分子材料所望塵莫及的生物組織相容性，對細胞的支撐彈性和可降解性，因此，膠原蛋白可以廣泛的應用在醫藥和化妝品等行業中。
2、天然膠原分子可形成一種特殊的超螺旋結構，這種結構是以3個氨基酸殘基為基本重復體的左手螺旋，這三個氨基酸殘基通常為gly-x-y。gly對膠原蛋白中氫鍵的形成是必須的，它本身沒有側鏈使膠原蛋白緊密堆積，能維持皮膚張力和彈性。
3、近年來隨著基因工程技術的廣泛應用，研發人員創造出各種類型的重組膠原蛋白，例如可以通過選擇來自天然人膠原蛋白的短氨基酸序列來構建重組膠原蛋白，這樣構建的重組膠原蛋白具有例如免疫原性低、生物活性高、穩定性好等優點。理論上，這種重組膠原蛋白的氨基酸序列越短，透皮吸收性能越好，但是氨基酸序列不是越短越好。如何設計短氨基酸序列，才能使得構建的重組膠原蛋白具有更好的透皮吸收性能，現有技術中沒有任何的理論可以作為指導。
4、xx型膠原蛋白(col20)是一種未被開發的膠原蛋白。根據其結構特征，xx型膠原是具有中斷三螺旋的原纖維相關膠原(facit)家族的一部分。人腦中col20a1?rna表達富集，睪丸和脾臟組織中的rna表達略有上升。目前xx型膠原蛋白的研究較
技術實現思路
1、針對目前的需要，專利技術人提供了新的xx型膠原蛋白。本文的xx型膠原蛋白具有促進細胞黏附的功效并且具有三螺旋結構。本專利技術還提供了生物合成人體結構性材料xx型膠原蛋白的方法。
2、在一方面，提供了膠原蛋白，其包含1個或多個重復單元，其中重復單元包含：
3、(1)以seq?id?no:9所示的氨基酸序列；或
4、(2)以seq?id?no:9所示的氨基酸序列中進行了一個或多個氨基酸殘基的突變的氨基酸序列；或
5、(3)與seq?id?no:9所示的氨基酸序列具有至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少95％、至少96％或至少99％相同的氨基酸序列。
6、在一個實施方案中，重復單元的數目是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20；各重復單元通過肽鍵直接連接或通過一個氨基酸或多個氨基酸的接頭連接。
7、在一個實施方案中，突變是取代、插入、缺失或添加；優選地，取代為保守氨基酸取代。
8、在一個實施方案中，所述膠原蛋白來源于人。
9、在一個實施方案中，所述膠原蛋白具有細胞黏附功效。
10、在一個實施方案中，所述膠原蛋白是重組膠原蛋白、重組人源化膠原蛋白或重組人源化xx型膠原蛋白。
11、在一個實施方案中，所述膠原蛋白是單鏈形式的膠原蛋白。
12、在一個實施方案中，添加是重復單元n端和/或c端的(gly-x-y)m的添加，其中x和y為任何氨基酸殘基，m為1-5。
13、在一個實施方案中，gly-x-y是ger、gek、gep或gts。
14、在一個實施方案中，重復序列包含以下氨基酸序列：
15、(1)以seq?id?no:1或8所示的氨基酸序列；
16、(2)與以seq?id?no:1或8所示的氨基酸序列具有至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列；或
17、(3)以seq?id?no:1或8所示的氨基酸序列中進行了一個或多個氨基酸殘基的突變的氨基酸序列；優選地，突變是取代、插入、缺失或添加；優選地，取代為保守氨基酸取代。
18、在一個實施方案中，膠原蛋白包含seq?id?no:1、2、5-9中任一項或者與seq?idno:1、2、5-9中任一項具有至少60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
19、在一方面，提供了膠原蛋白，其包含1個或多個重復單元，重復單元包含以seq?idno:1或8所示的氨基酸序列或以seq?id?no:1或8所示的氨基酸序列中進行了一個或多個氨基酸殘基的突變的氨基酸序列或與seq?id?no:1或8所示的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少95％、至少96％或至少99％相同的氨基酸序列；重復單元的數目是2-20、3-16或4-8。
20、在一個實施方案中，重復單元的數目是2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。
21、在一個實施方案中，各重復單元通過肽鍵直接連接或通過一個氨基酸或多個氨基酸殘基的接頭連接。在一個實施方案中，接頭包含2、3、4、5、6、7或8個氨基酸殘基。
22、在一個實施方案中，突變是取代、插入、缺失或添加。在一個實施方案中，取代為保守氨基酸取代。
23、在一個實施方案中，膠原蛋白來源于人。在一個實施方案中，膠原蛋白具有三螺旋結構。在一個實施方案中，三螺旋結構是由三條相同的單鏈形式的膠原蛋白形成的。在一個實施方案中，膠原蛋白具有細胞黏附功效。在一個實施方案中，膠原蛋白是重組膠原蛋白、重組人源化膠原蛋白或重組人源化xx型膠原蛋白。
24、在一個實施方案中，膠原蛋白包含以下氨基酸序列：
25、(1)以seq?id?no:2所示的氨基酸序列；
26、(2)與以seq?id?no:2所示的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列；或
27、(3)以seq?id?no:2所示的氨基酸序列中進行了一個或多個氨基酸殘基的突變的氨基酸序列。
28、在一個實施方案中，突變是取代、插入、缺失或添加。在一個實施方案中，取代為保守氨基酸取代。
29、在一方面，提供了融合蛋白，其包含本文的膠原蛋白和用于促進膠原蛋白分泌、分離和/或純化的蛋白質。
30、在一個實施方案中，所述蛋白質選自酶切位點序列、信號肽和純化標簽序列。
31、在一個實施方案中，所述酶切位點序列是tev蛋白酶酶切位點序列。
32、在一個實施方案中，蛋白標簽序列his標簽、gst標簽、本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.膠原蛋白，其包含1個或多個重復單元，其中重復單元包含：
2.根據權利要求1的膠原蛋白，其中所述添加是重復單元N端和/或C端的(Gly-X-Y)m的添加，其中X和Y為任何氨基酸殘基，m為1-5；
3.融合蛋白，其包含根據權利要求1或2的膠原蛋白和用于促進膠原蛋白分泌、分離和/或純化的蛋白質；
4.核酸，其編碼根據權利要求1或2所述的膠原蛋白或權利要求3的融合蛋白；優選地，其中所述核酸包含以SEQ?ID?NO:3所示的核苷酸序列。
5.載體，其包含根據權利要求4所述的核酸，任選地，所述載體包含編碼純化標簽的核苷酸、編碼前導物的核苷酸和/或調節元件；
6.宿主細胞，其包含根據權利要求4所述的核酸或根據權利要求5所述的載體；其中優選地，宿主細胞是真核細胞或原核細胞；其中優選地，真核細胞是酵母細胞、動物細胞和/或昆蟲細胞，和/或原核細胞是大腸桿菌細胞，例如大腸桿菌BL21；優選地，酵母細胞是釀酒酵母或畢赤酵母，如巴斯德畢赤酵母。
7.生產膠原蛋白的方法，其包括：
8.具有三螺旋結構的膠原蛋白，其包含三條
9.組合物，其包含根據權利要求1或2所述的膠原蛋白、根據權利要求3的融合蛋白、根據權利要求4所述的核酸、根據權利要求5所述的載體、根據權利要求6所述的宿主細胞和/或根據權利要求8所述的具有三螺旋結構的膠原蛋白；
10.使促進細胞黏附或貼壁的方法，所述方法包括使細胞與根據權利要求1或2所述的膠原蛋白、根據權利要求8所述的具有三螺旋結構的膠原蛋白和/或根據權利要求9的組合物接觸。
11.根據權利要求1或2所述的膠原蛋白、根據權利要求3所述的融合蛋白、根據權利要求4的核酸、根據權利要求5所述的載體、根據權利要求6所述的宿主細胞、根據權利要求8所述的具有三螺旋結構的膠原蛋白和/或根據權利要求8的組合物接觸在生物敷料、人體仿生材料、整形美容材料、類器官培養材料、心血管支架材料、涂層材料、組織注射填充材料、眼科材料、婦產科生物材料、神經修復再生材料、肝臟組織材料及血管修復再生材料和3D打印人造器官中的一種或多種中的用途。
12.根據權利要求1或2所述的膠原蛋白、根據權利要求3所述的融合蛋白、根據權利要求8所述的具有三螺旋結構的膠原蛋白和/或根據權利要求9的組合物接觸在制備用于促進細胞黏附或貼壁的藥物或試劑盒的用途。
13.形成三螺旋結構形式的膠原蛋白的方法，其包括將單鏈形式的根據權利要求1或2所述的膠原蛋白溶解于水或緩沖劑，例如D-PBS緩沖劑或PBS緩沖劑的步驟。
14.一種美容方法，其包括對受試者施用根據權利要求1或2所述的膠原蛋白、根據權利要求8所述的具有三螺旋結構的膠原蛋白和/或根據權利要求9的組合物；優選地，施用是口服施用。
15.篩選膠原蛋白的方法，其包括：對SEQ?ID?NO:9的氨基酸序列進行一個或多個氨基酸殘基的突變，以獲得膠原蛋白文庫；
...【技術特征摘要】
1.膠原蛋白，其包含1個或多個重復單元，其中重復單元包含：
2.根據權利要求1的膠原蛋白，其中所述添加是重復單元n端和/或c端的(gly-x-y)m的添加，其中x和y為任何氨基酸殘基，m為1-5；
3.融合蛋白，其包含根據權利要求1或2的膠原蛋白和用于促進膠原蛋白分泌、分離和/或純化的蛋白質；
4.核酸，其編碼根據權利要求1或2所述的膠原蛋白或權利要求3的融合蛋白；優選地，其中所述核酸包含以seq?id?no:3所示的核苷酸序列。
5.載體，其包含根據權利要求4所述的核酸，任選地，所述載體包含編碼純化標簽的核苷酸、編碼前導物的核苷酸和/或調節元件；
6.宿主細胞，其包含根據權利要求4所述的核酸或根據權利要求5所述的載體；其中優選地，宿主細胞是真核細胞或原核細胞；其中優選地，真核細胞是酵母細胞、動物細胞和/或昆蟲細胞，和/或原核細胞是大腸桿菌細胞，例如大腸桿菌bl21；優選地，酵母細胞是釀酒酵母或畢赤酵母，如巴斯德畢赤酵母。
7.生產膠原蛋白的方法，其包括：
8.具有三螺旋結構的膠原蛋白，其包含三條相同的單鏈形式的根據權利要求1或2所述的膠原蛋白。
9.組合物，其包含根據權利要求1或2所述的膠原蛋白、根據權利要求3的融合蛋白、根據權利要求4所述的核酸、根據權利要求5所述的載體、根據權利要求6所述的宿主細胞和/或根據權利要求8所述的具有三螺旋結構的膠原蛋白；
10.使促進細胞黏...
【專利技術屬性】
技術研發人員：陸路，楊霞，姜世勃，花晨，王茜，徐巍，蘭小賓，王建，
申請(專利權)人：山西錦波生物醫藥股份有限公司，
類型：發明
國別省市：
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