【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于細胞培養，更具體地，涉及一種貓豆胚性愈傷增殖的懸浮培養方法及其應用。
技術介紹
1、貓豆為豆科黎豆屬植物，又名黎豆(藜豆)、狗爪豆、龍爪豆、虎豆、老鼠豆等，是生長在亞熱帶地區的一年生纏繞草質藤本植物，在廣西、廣東、貴州、云南、海南以及江西等地區均有種植。貓豆具有耐旱耐貧瘠、適應性強等特點，非常適宜于喀斯特石漠化地區種植。廣西百色、河池等典型的喀斯特地貌地區均有種植貓豆。
2、貓豆富含左旋多巴(l-dopa)，豆粒中左旋多巴含量在6～9％，是生物體內一種重要的生物活性物質，是從l-酪氨酸到兒茶酚或黑色素的生化代謝途徑中的重要中間產物，是臨床上用于治療老年人帕金森氏病所引起的震顫麻痹的特效藥物。而貓豆種子則為目前提取左旋多巴的主要原材料，因貓豆為一年生植物，在生產上主要以收獲種子進行保種并進行左旋多巴的提取，又由于貓豆產量有限等多方面問題難以滿足目前市場需求。
3、關于貓豆通過細胞懸浮培養實現利用人工手段短期內實現生產增益的研究并不多，杭玲等(2001)對黎豆組織細胞培養發生植株再生進行了研究，獲得了初期的胚性愈傷組織，但增殖較慢，無法用于產業化。而植物細胞懸浮培養具有生長快、環境和營養要求可控的優勢，還可以開展次生代謝產物的開發和利用，實現大幅度增殖，是進行產業化的必經之路。但目前并未見有關如何建立高效穩定的貓豆胚性愈傷組織懸浮培養的報道。因此，能否提供一種貓豆胚性愈傷細胞增殖的懸浮培養方法是本領域技術人員急需解決的問題。
技術實現思路
1、本專
2、本專利技術的第二個目的在于提供所述一種貓豆胚性愈傷增殖的懸浮培養方法。
3、本專利技術的第三個目的在于提供所述懸浮培養方法培養得到的貓豆胚性愈傷懸浮細胞系。
4、本專利技術的第四個目的在于提供所述貓豆胚性愈傷懸浮細胞系的應用。
5、本專利技術的上述目的是通過以下技術方案給予實現的：
6、本專利技術首先提供一種貓豆胚性愈傷增殖的培養基組合，包括以下培養基：
7、培養基①：ms培養基加卡拉膠7.5～8.8g/l、蔗糖20～30g/l、vc?0.5～1.5mg/l；
8、培養基②：ms培養基加卡拉膠7.5～9.5g/l、蔗糖15～30g/l、6-ba0.5～1.5mg/l、naa0.05～0.5mg/l；
9、培養基③：ms培養基加卡拉膠7.5～10g/l、蔗糖10～35g/l、6-ba?1.0～3.0mg/l、naa?0.05～1.0mg/l、vc?0.5～1.0mg/l；
10、培養基④：1/2ms培養基加蔗糖10～15g/l、6-ba?3.0～4.5mg/l、naa?0.05～0.8mg/l、vc?0.5～2.0mg/l。
11、其中，所述1/2ms培養基為ms培養基配方中大量元素減半。
12、本專利技術所提供的貓豆胚性愈傷增殖的培養基組合，按照培養基①配方能建立起貓豆種子萌發體系，保持穩定的發芽率；按照培養基②配方對誘導貓豆胚性愈傷的培養起到重要作用，其他配方不能誘導出愈傷組織或誘導出的愈傷組織發白不呈現胚性狀態；按照培養基③配方對保持胚性愈傷狀態并進行增加愈傷增殖起到重要作用，添加vc在于提高其抗氧化能力；通過對培養基④中的基礎培養基及所添加的激素進行篩選，得到以1/2ms培養基為基礎培養基，培養的貓豆愈傷組織保持最佳狀態的時間更長，活力更佳，而其它基礎培養基均不能實現該效果。而將其中的naa替換為其它激素則會出現效果差，懸浮培養維持時間短且出現懸浮培養發褐發黑現象，不能保持細胞活性，體系建立不起來；因此，按照培養基④配方能夠較好地建立起貓豆懸浮培養細胞系，得到組織狀態良好的貓豆胚性愈傷懸浮細胞系。綜上所述，本專利技術所提供的培養基組合適用于貓豆胚性愈傷細胞增殖的懸浮培養，可建立高效穩定的貓豆胚性愈傷組織懸浮培養。
13、進一步地，所述培養基④中naa的添加量為0.05～0.1mg/l。
14、優選地，所述貓豆胚性愈傷增殖的培養基組合，包括以下培養基：
15、培養基①：ms培養基加卡拉膠7.5g/l、蔗糖30g/l、vc?0.5mg/l；
16、培養基②：ms培養基加卡拉膠7.5g/l、蔗糖30g/l、6-ba?0.5mg/l、naa?0.05mg/l；
17、培養基③：ms培養基加卡拉膠7.5g/l、蔗糖30g/l、6-ba?3.0mg/l、naa?0.05mg/l、vc?0.5mg/l；
18、培養基④：1/2ms培養基加蔗糖15g/l、6-ba?3.0mg/l、naa?0.05mg/l、vc?0.5mg/l。
19、本專利技術還提供一種貓豆胚性愈傷增殖的懸浮培養方法，包括以下步驟：
20、s1.貓豆種子消毒：將種子沖洗、浸泡、消毒，去種皮處理后接種于上述所述培養基①中，誘導種子萌發至生長成為具有兩對葉片的植株；
21、s2.貓豆胚性愈傷組織誘導：將s1所得植株的葉片進行創傷處理后接種于上述所述培養基②中培養，獲得胚性愈傷；
22、s3.貓豆胚性愈傷懸浮培養初始材料的篩選：將s2所得胚性愈傷接種于上述所述培養基③中進行增殖培養，再進行3～4代愈傷繼代篩選，獲得胚性愈傷懸浮培養初始材料；
23、s4.貓豆胚性愈傷懸浮初級培養：將s3得到的胚性愈傷懸浮培養初始材料轉接到上述所述培養基④中進行懸浮培養，篩選3～4代后獲得胚性愈傷懸浮物；
24、s5.貓豆胚性愈傷細胞懸浮增殖培養：將s4得到的胚性愈傷懸浮物，沉淀處理，取沉積胚性組織加入上述所述培養基④進行懸浮培養，取培養后的沉積胚性組織接入上述所述培養基④中進行繼代增殖懸浮震蕩培養，獲得貓豆胚性愈傷懸浮細胞系。
25、其中，本專利技術在貓豆胚性愈傷懸浮培養初始材料的篩選中，對不同愈傷繼代進行了不同代系的胚性愈傷進行篩選，研究表明，過少或過多的愈傷繼代得到的胚性愈傷組織作為初級懸浮培養材料，在后續培養中的愈傷組織狀態不佳趨于死亡，或所得懸浮組織產生左旋多巴含量少和組織活性也較差，只有3～4代胚性愈傷在后續培養中組織狀態好，其產生的左旋多巴含量較高且活性較佳。因此，本專利技術所提供的貓豆胚性愈傷增殖的懸浮培養方法可建立穩定的貓豆胚性愈傷懸浮細胞系，細胞系建立起來能夠為細胞融合、轉基因等分子研究以及次生代謝研究提供很大的原材料，通過次級代謝產物的研究能夠為左旋多巴研究提供更多理論依據和參考。
26、進一步地，步驟s1中所述種子為采集收取成熟帶有豆莢的貓豆莢，輕輕剝去豆莢，得到灰白色的種子。
27、進一步地，步驟s1中所述沖洗、浸泡、消毒為流水沖洗后洗潔精震蕩處理，流水沖洗至無泡沫，75％酒精處理，無菌水沖洗，0.1％?hgcl溶液消毒8～10min，無菌水沖洗。
28、其中，所述步驟s1中若消毒時間不足或省略其中的消毒步驟本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種貓豆胚性愈傷增殖的培養基組合，其特征在于，包括以下培養基：
2.一種貓豆胚性愈傷增殖的懸浮培養方法，其特征在于，包括以下步驟：
3.根據權利要求2所述懸浮培養方法，其特征在于，步驟S1中所述沖洗、浸泡、消毒為流水沖洗后洗潔精震蕩處理，流水沖洗至無泡沫，75％酒精處理，無菌水沖洗，0.1％HgCl溶液消毒8～10min，無菌水沖洗。
4.根據權利要求2所述懸浮培養方法，其特征在于，步驟S2中所述培養為暗處理培養至葉片卷曲，再進行光照培養至形成愈傷獲得胚性愈傷。
5.根據權利要求2所述懸浮培養方法，其特征在于，步驟S3中所述胚性愈傷為具有松散、生長快、活力旺盛的胚性愈傷。
6.根據權利要求2所述懸浮培養方法，其特征在于，步驟S3所述增殖培養在光照環境下，溫度23～27℃培養。
7.根據權利要求2所述懸浮培養方法，其特征在于，步驟S4、S5中所述懸浮培養條件為在光照環境下，轉速120r/min、溫度23～27℃震蕩培養。
8.權利要求2～7任一所述懸浮培養方法培養得到的貓豆胚性愈傷懸浮細胞系。<...
【技術特征摘要】
1.一種貓豆胚性愈傷增殖的培養基組合，其特征在于，包括以下培養基：
2.一種貓豆胚性愈傷增殖的懸浮培養方法，其特征在于，包括以下步驟：
3.根據權利要求2所述懸浮培養方法，其特征在于，步驟s1中所述沖洗、浸泡、消毒為流水沖洗后洗潔精震蕩處理，流水沖洗至無泡沫，75％酒精處理，無菌水沖洗，0.1％hgcl溶液消毒8～10min，無菌水沖洗。
4.根據權利要求2所述懸浮培養方法，其特征在于，步驟s2中所述培養為暗處理培養至葉片卷曲，再進行光照培養至形成愈傷獲得胚性愈傷。
5.根據權利要求2所述懸浮培養方法，其特征在于，步驟s3中所...
【專利技術屬性】
技術研發人員：王潔華，何蘊軒，趙錫蝶，宋文芹，
申請(專利權)人：津寧植化廣州科技發展有限責任公司，
類型：發明
國別省市：
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