【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)屬于生物，具體涉及一種高產(chǎn)棘白菌素b的基因工程菌株構(gòu)建方法和應(yīng)用。
技術(shù)介紹
1、棘白菌素b是由曲霉屬菌株產(chǎn)生的天然次生代謝物，它是臨床一線抗真菌藥物阿尼芬凈的半合成前體，由于阿尼芬凈在臨床治療中的優(yōu)異表現(xiàn)，使得它從眾多的抗真菌藥物中脫穎而出，然而目前它的半合成前體棘白菌素b只能通過(guò)微生物發(fā)酵產(chǎn)生而不能通過(guò)化學(xué)合成，而生物發(fā)酵產(chǎn)生相對(duì)于化工合成的周期更長(zhǎng)，過(guò)程更為復(fù)雜，產(chǎn)量卻較低。因此，提升棘白菌素b產(chǎn)量或降低生產(chǎn)成本顯得十分重要。
2、目前應(yīng)用于提高棘白菌素b發(fā)酵產(chǎn)量的策略包括通過(guò)優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)條件以及結(jié)合非定向誘變獲得高產(chǎn)菌株，也有研究基于生產(chǎn)菌株的遺傳背景進(jìn)行代謝通路改造進(jìn)而提升發(fā)酵產(chǎn)量。通過(guò)培養(yǎng)基優(yōu)化提升發(fā)酵產(chǎn)量是目前應(yīng)用較多的策略，因?yàn)樗鼰o(wú)需建立遺傳操作體系，易于操作，并且能夠在較短的時(shí)間達(dá)到提升產(chǎn)量的目的。同時(shí)，由于不同的菌株在發(fā)酵時(shí)對(duì)營(yíng)養(yǎng)成分的要求不同，在獲得改造的菌株后也通常需要通過(guò)培養(yǎng)條件優(yōu)化尋找最適宜該菌株發(fā)酵生產(chǎn)的條件；在利用生物反應(yīng)器進(jìn)行生產(chǎn)合成的過(guò)程中，外界營(yíng)養(yǎng)環(huán)境(碳源、氮源和氨基酸)和物理化學(xué)因素(溫度、光和ph等)都能夠影響到發(fā)酵進(jìn)程。然而在工業(yè)生產(chǎn)發(fā)酵過(guò)程中僅僅改變發(fā)酵條件經(jīng)常會(huì)遇到難以克服的許多問(wèn)題，如發(fā)酵液粘度高、供氧不足以及原料限制等問(wèn)題，都容易導(dǎo)致突破、提升發(fā)酵產(chǎn)量的瓶頸難點(diǎn)。另外，通過(guò)誘變獲得高產(chǎn)菌株具有隨機(jī)和不確定性導(dǎo)致篩選工作量巨大，效率低下等不足。因此，通過(guò)目的基因定向改造對(duì)生產(chǎn)菌株進(jìn)行遺傳編輯操作，按照預(yù)想的生物合成過(guò)程構(gòu)建工程菌株，對(duì)相應(yīng)的目的基因進(jìn)行編輯
3、aspergillus?pachycristatus?nrrl?11440是用于生產(chǎn)棘白菌素b的工業(yè)菌株，因此對(duì)它的遺傳背景和棘白菌素b生物合成調(diào)控機(jī)制相關(guān)研究已經(jīng)有了一定的積累。然而，發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化以及誘變育種獲得高產(chǎn)菌株策略造成的副產(chǎn)物積累和誘變結(jié)果的不確定性很大程度上增加了后續(xù)產(chǎn)物處理以及高產(chǎn)菌株篩選所需的成本。因此，該菌株發(fā)酵產(chǎn)量不高導(dǎo)致棘白菌素b類抗真菌藥生產(chǎn)成本居高不下。除該菌株之外，人們也已經(jīng)分離到曲霉屬中的一些菌株，也可以發(fā)酵產(chǎn)生棘白菌素b發(fā)酵產(chǎn)品。由于目前還沒(méi)有解析清楚棘白菌素b的合成基因簇，目前大多的提升棘白菌素b發(fā)酵產(chǎn)量的研究主要聚焦于發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化。同時(shí)，人們也通過(guò)誘變育種，獲得隨機(jī)突變的菌株可以在一定程度上提高產(chǎn)量。然而，通過(guò)目的基因定向高調(diào)或者編輯目前還鮮有報(bào)道。因此，尋找一種提升棘白菌素b的基因編輯方法構(gòu)建高產(chǎn)菌株具有重要科學(xué)價(jià)值和潛在應(yīng)用作用。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、專利技術(shù)目的：針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的問(wèn)題，本專利技術(shù)提供一種高產(chǎn)棘白菌素b的基因工程菌株，本專利技術(shù)利用ecda和htyf聯(lián)合高表達(dá)提升棘白菌素b發(fā)酵產(chǎn)量，運(yùn)用分子生物學(xué)的方法將原始菌株中的ecda原始啟動(dòng)子替換為組成型強(qiáng)啟動(dòng)子gpda，獲得ecda高表達(dá)工程菌株；在此工程菌株上對(duì)htyf高表達(dá)，獲得ecda與htyf共同高表達(dá)工程菌株。本專利技術(shù)構(gòu)建的工程菌株均強(qiáng)化棘白菌素b合成途徑，顯著提高了具備產(chǎn)生棘白菌素基因簇的菌株的棘白菌素b產(chǎn)量，具有潛在的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。
2、本專利技術(shù)還提供所述基因工程菌株的構(gòu)建方法與應(yīng)用。
3、技術(shù)方案：為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本專利技術(shù)所述一種高產(chǎn)棘白菌素b的基因工程菌株，所述工程菌株以具備產(chǎn)生棘白菌素基因簇的菌株為底盤(pán)菌，在底盤(pán)菌中高表達(dá)ecda基因和/或htyf基因所得。
4、其中，所述ecda基因和htyf基因的序列分別為jx421684.1(41269-63178)和jx421685.1(22453-25202)。
5、其中，所述具備產(chǎn)生棘白菌素基因簇的菌株包括厚冠突曲霉。作為優(yōu)選，所述厚冠突曲霉為aspergillus?pachycristatus?nrrl?11440(cpcc400818)。
6、本專利技術(shù)所述的高產(chǎn)棘白菌素b的基因工程菌株的構(gòu)建方法，包括如下步驟：
7、(1)以ecda基因序列設(shè)計(jì)引物，以底盤(pán)菌的基因組dna作為模板，pcr擴(kuò)增得到左右同源臂；將左右臂與含有g(shù)pda啟動(dòng)子的片段融合，融合完成導(dǎo)入底盤(pán)菌的原生質(zhì)體，得到菌株lp-1；
8、(2)以htyf基因序列設(shè)計(jì)引物，以底盤(pán)菌的基因組dna作為模板，pcr擴(kuò)增得到htyf基因，與載體連接后獲得高調(diào)htyf質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)入菌株lp-1的原生質(zhì)體中，得到菌株lp-2。
9、其中，步驟(1)所述的引物序列包括ecda-l-f/ecda-l-r(seq?id?no.1-2)和ecda-r-f/ecda-r-r(seq?id?no.3-4)：
10、ecda-l-f?tgtactgtctgtagcgagca
11、ecda-l-r?taatcaattgcccgtctgtcaaggtcattcaagagtgaaacecda-r-f?catccaagaacctttaatcaatggaacggaaacgcgtatt
12、ecda-r-r?aggatattggcctggaactg。
13、其中，步驟(1)中通過(guò)同源重組方式將基因原生啟動(dòng)子替換為組成型強(qiáng)啟動(dòng)子，所述的組成型強(qiáng)啟動(dòng)子為gpda(3-磷酸甘油醛脫氫酶)啟動(dòng)子。
14、其中，步驟(2)所述的引物序列包括oe-htyf,ecorⅴ-f和oe-htyf,ecorⅴ-r(seqid?no.5-6)：
15、oe-htyf,ecorⅴ-f：
16、ggctgcaggaattcgatatcatgctcgctacagacagtac
17、oe-htyf,ecorⅴ-r：
18、gtatcgataagcttgatatcctaattctttgtggccgatg。
19、其中，步驟(2)所述的載體為pbargpe1-hygro質(zhì)粒，所述htyf高調(diào)質(zhì)粒包含組成型強(qiáng)啟動(dòng)子gpda、htyf基因、終止子trpc和抗性篩選標(biāo)記。
20、進(jìn)一步地，步驟(2)中htyf高表達(dá)方式是通過(guò)隨機(jī)轉(zhuǎn)入htyf高調(diào)質(zhì)粒，增加基因拷貝數(shù)；所述的htyf的生物學(xué)功能是將棘白菌素b前體物nnu-1氧化修飾轉(zhuǎn)化為棘白菌素b。棘白菌素b前體物nnu-1，該物質(zhì)核質(zhì)比為1044.3[m+h]+，在本專利技術(shù)的lc-ms檢測(cè)條件下，保留時(shí)間在26.5～27.5min。
21、本專利技術(shù)所述的高產(chǎn)棘白菌素b的基因工程菌株在生產(chǎn)棘白菌素b中的應(yīng)用。
22、本專利技術(shù)所述ecda基因和/或htyf基因在調(diào)控具備產(chǎn)生棘白菌素基因簇的菌株的棘白菌素b產(chǎn)量中的應(yīng)用。
23、本專利技術(shù)使用ecda和htyf共同高調(diào)提升棘白菌素b產(chǎn)量的構(gòu)建方法與應(yīng)用，適用于所有能夠合成棘白菌素b并且含有棘白菌素b生物合成基因簇的物種。
24、本專利技術(shù)提出了一種聯(lián)合高表達(dá)具備產(chǎn)生棘白菌素基因簇的菌株如厚冠突曲霉(as本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.一種高產(chǎn)棘白菌素B的基因工程菌株，其特征在于，所述工程菌株以具備產(chǎn)生棘白菌素基因簇的菌株為底盤(pán)菌，在底盤(pán)菌中高表達(dá)ecdA基因和/或htyF基因所得。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高產(chǎn)棘白菌素B的基因工程菌株，其特征在于，所述ecdA基因和htyF基因的序列分別為JX421684.1(41269-63178)和JX421685.1(22453-25202)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高產(chǎn)棘白菌素B的基因工程菌株，其特征在于，所述具備產(chǎn)生棘白菌素基因簇的菌株優(yōu)選包括厚冠突曲霉。
4.一種權(quán)利要求1所述的高產(chǎn)棘白菌素B的基因工程菌株的構(gòu)建方法，其特征在于，包括如下步驟：
5.根據(jù)權(quán)利要求4的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟(1)所述的引物序列包括ecdA-L-F/ecdA-L-R(SEQ?ID?NO.1-2)和ecdA-R-F/ecdA-R-R(SEQ?ID?NO.3-4)：
6.根據(jù)權(quán)利要求4的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟(1)中通過(guò)同源重組方式將基因原生啟動(dòng)子替換為組成型強(qiáng)啟動(dòng)子，所述的組成型強(qiáng)啟動(dòng)子為gpdA(3-磷酸甘油醛脫
7.根據(jù)權(quán)利要求4的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟(2)所述的引物序列包括OE-htyF,EcoRⅤ-F和OE-htyF,EcoRⅤ-R(SEQ?ID?NO.5-6)：
8.根據(jù)權(quán)利要求4的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟(2)所述的載體為pBARGPE質(zhì)粒，所述htyF高調(diào)質(zhì)粒包含組成型強(qiáng)啟動(dòng)子gpdA、htyF基因、終止子trpC和抗性篩選標(biāo)記。
9.一種權(quán)利要求1所述的高產(chǎn)棘白菌素B的基因工程菌株在生產(chǎn)棘白菌素B中的應(yīng)用。
10.一種ecdA基因和/或htyF基因在調(diào)控具備產(chǎn)生棘白菌素基因簇的菌株的棘白菌素B產(chǎn)量中的應(yīng)用。
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種高產(chǎn)棘白菌素b的基因工程菌株，其特征在于，所述工程菌株以具備產(chǎn)生棘白菌素基因簇的菌株為底盤(pán)菌，在底盤(pán)菌中高表達(dá)ecda基因和/或htyf基因所得。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高產(chǎn)棘白菌素b的基因工程菌株，其特征在于，所述ecda基因和htyf基因的序列分別為jx421684.1(41269-63178)和jx421685.1(22453-25202)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高產(chǎn)棘白菌素b的基因工程菌株，其特征在于，所述具備產(chǎn)生棘白菌素基因簇的菌株優(yōu)選包括厚冠突曲霉。
4.一種權(quán)利要求1所述的高產(chǎn)棘白菌素b的基因工程菌株的構(gòu)建方法，其特征在于，包括如下步驟：
5.根據(jù)權(quán)利要求4的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟(1)所述的引物序列包括ecda-l-f/ecda-l-r(seq?id?no.1-2)和ecda-r-f/ecda-r-r...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：陸玲，羅攀，蔣凱麗，王欣欣，宋萍，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：南京師范大學(xué)，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：
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