【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于生物醫藥，尤其涉及一種增強car-t細胞抗實體瘤效果的細菌外膜囊泡體系及其制備方法和應用。
技術介紹
1、嵌合抗原受體t細胞(chimeric?antigen?receptor?t-cell,car-t細胞)療法，是指利用經過基因工程改造的能表達靶向特定抗原的t細胞，實現對腫瘤的靶向殺傷。雖然car-t療法在血液腫瘤的治療中取得了突破性的成功，但針對數量更為龐大的實體瘤患者的療效卻始終不佳。一個關鍵的挑戰在于實體腫瘤存在抑制性的腫瘤微環境，阻礙car-t細胞的浸潤以及效應功能。此外，由于其固有的抗原異質性特征，并非所有腫瘤細胞都表達car靶向的抗原，靶向治療的選擇壓力常導致治療過程中出現抗原丟失以及抗原逃逸的問題，進而導致car-t細胞的脫靶及耐藥，嚴重影響患者的生存預后。
2、近年來，含有大量來自親代細菌成分的細菌外膜囊泡，由于能夠引發強大的免疫反應并發揮促炎作用，改善抑制性的腫瘤微環境而廣泛應用于腫瘤的免疫治療。其在體內無法復制，不具有傳染性，相比于母體細菌具有更好的安全性。另一方面，細菌外膜囊泡作為一種有吸引力的新興貨物運輸平臺，已廣泛用于藥物，rna，質粒等的遞送，能夠被腫瘤細胞有效內化，實現對腫瘤組織的基因修飾。目前關于細菌外膜囊泡作為具有免疫調節活性的遞送載體，克服car-t療法在實體腫瘤中困境的作用，尚未見報道。
技術實現思路
1、本專利技術的目的在于克服現有技術存在的缺陷和不足，提供一種增強car-t細胞抗實體瘤效果的細菌外膜囊泡體系及其制
2、本專利技術的第一個技術方案在于提供一種增強car-t細胞抗實體瘤效果的細菌外膜囊泡體系，由表面能表達apd-l1抗體的細菌外膜囊泡構成，且內部負載有編碼腫瘤抗原的質粒。
3、優選地，所述細菌外膜囊泡來源包括但不限于大腸桿菌、霍亂弧菌、福氏志賀氏菌等，進一步優選地，所述大腸桿菌可為w3110、dh5α、或bl21菌株。
4、優選地，所述編碼的腫瘤抗原包括但不限于her2抗原胞外段(her2?ecd)、以及其他實體腫瘤car-t細胞的靶標抗原。
5、優選地，所述細菌外膜囊泡平均粒徑為78.7nm～122.4nm。
6、本專利技術的第二個技術方案在于提供一種增強car-t細胞抗實體瘤效果的細菌外膜囊泡體系的制備方法，包括以下步驟：
7、s1、將表達細菌溶血素蛋白clya的基因序列克隆至pet28a(+)質粒中；
8、s2、將能夠表達apd-l1抗體的基因序列克隆至含有clya基因序列的pet28a(+)質粒中，獲得含有表達apd-l1抗體的基因序列的質粒；
9、s3、將步驟s2所得質粒轉化進靶細菌，建立穩定表達apd-l1抗體細菌株；
10、s4、收集步驟s3所得細菌株，加入異丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)誘導蛋白表達，經梯度離心，過濾得到表達apd-l1抗體的細菌外膜囊泡；
11、s5、將編碼表達腫瘤抗原的質粒負載到步驟s4所得細菌外膜囊泡中，得到所述體系。
12、優選地，步驟s5所述負載編碼腫瘤抗原質粒時采用電穿孔的方式。
13、在本專利技術一個具體實施例中，首先利用基因工程技術將apd-l1抗體表達在細菌上，然后經梯度離心、過濾得到表達apd-l1抗體的細菌外膜囊泡，具有靶向腫瘤表面pd-l1蛋白且阻斷pd-1/pd-l1抑制性信號的作用，然后通過電穿孔將編碼her2?ecd的質粒負載在該細菌外膜囊泡中，一方面可將her2?ecd作為抗原修飾至腫瘤細胞表面，解決實體瘤廣泛存在的抗原異質性問題，另一方面細菌外膜囊泡能夠有效改善抑制性的腫瘤微環境并能夠顯著的增強car-t細胞介導的抗腫瘤免疫療效。該功能化細菌外膜囊泡有望成為car-t療法的一種新的配套藥物，為增強car-t治療實體瘤提供新的選擇手段。
14、本專利技術的第三個技術方案在于提供上述細菌外膜囊泡體系在制備增強car-t細胞抗實體腫瘤效果的藥物制劑中的應用，可以更好的增強car-t細胞的抗實體瘤效果。
15、優選地，所述實體腫瘤包括乳腺癌、肝癌。
16、與現有技術相比，本專利技術的有益效果是：
17、(1)本專利技術通過將apd-l1抗體表達在細菌外膜囊泡上，可起到主動靶向腫瘤組織及阻斷pd-1/pd-l1抑制性信號軸的作用，避免car-t細胞過早的發生衰竭。
18、(2)本專利技術通過將編碼her2?ecd的質粒加載在細菌外膜囊泡中，可利用細菌外膜囊泡的靶向遞送作用將質粒內化至腫瘤細胞內從而將抗原修飾至細胞表面，以解決實體瘤治療過程中導致的抗原陰性問題。
19、(3)本專利技術通過細菌外膜囊泡自身能夠引發強大的免疫反應作用，改善抑制性的腫瘤微環境的特點，增強car-t細胞的浸潤及效應功能。
20、(4)由于本專利技術使用基因重編程細菌外膜囊泡負載編碼表達her2?ecd的質粒能夠有效將抗原修飾至腫瘤細胞表面，提高car-t細胞對腫瘤的靶向識別能力；同時細菌外膜囊泡能夠有效改善抑制性的腫瘤微環境，增加car-t細胞在腫瘤內的浸潤及活化殺傷能力，可以更好的增強car-t細胞的抗實體瘤效果。
21、(5)本專利技術提供的一個平臺技術具有普適性，為增強car-t治療實體瘤提供新的選擇手段，具有廣闊的應用前景。
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1.一種增強CAR-T細胞抗實體瘤效果的細菌外膜囊泡體系，其特征在于，由表面表達aPD-L1抗體的細菌外膜囊泡構成，且內部負載有編碼腫瘤抗原的質粒。
2.根據權利要求1所述的細菌外膜囊泡體系，其特征在于，所述細菌外膜囊泡來源包括大腸桿菌、霍亂弧菌、福氏志賀氏菌。
3.根據權利要求1所述的細菌外膜囊泡體系，其特征在于，所述大腸桿菌包括W3110、DH5α、BL21菌株。
4.根據權利要求1所述的細菌外膜囊泡體系，其特征在于，所述編碼的腫瘤抗原包括HER2?ECD。
5.根據權利要求1所述的細菌外膜囊泡體系，其特征在于，所述細菌外膜囊泡平均粒徑為78.7nm～122.4nm。
6.權利要求1-5任一項所述的細菌外膜囊泡體系的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：
7.根據權利要求6所述的制備方法，其特征在于，步驟S5所述負載采用電穿孔的方式。
8.根據權利要求1所述的細菌外膜囊泡體系在制備增強CAR-T細胞抗實體腫瘤效果的藥物制劑中的應用。
9.根據權利要求8所述的應用，其特征在于，所述實體
...【技術特征摘要】
1.一種增強car-t細胞抗實體瘤效果的細菌外膜囊泡體系，其特征在于，由表面表達apd-l1抗體的細菌外膜囊泡構成，且內部負載有編碼腫瘤抗原的質粒。
2.根據權利要求1所述的細菌外膜囊泡體系，其特征在于，所述細菌外膜囊泡來源包括大腸桿菌、霍亂弧菌、福氏志賀氏菌。
3.根據權利要求1所述的細菌外膜囊泡體系，其特征在于，所述大腸桿菌包括w3110、dh5α、bl21菌株。
4.根據權利要求1所述的細菌外膜囊泡體系，其特征在于，所述編碼的腫瘤抗原包括her2?ecd。
【專利技術屬性】
技術研發人員：鄭桐森，李咸君，李雪寒，李應敬，時佳琪，張涵語，
申請(專利權)人：哈爾濱醫科大學附屬腫瘤醫院哈爾濱醫科大學附屬第三醫院，哈爾濱醫科大學第三臨床醫學院，黑龍江省腫瘤醫院，
類型：發明
國別省市：
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