【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本申請屬于異種移植領(lǐng)域，具體涉及工程化細(xì)胞系的構(gòu)建方法及在豬細(xì)胞內(nèi)表達(dá)人cd64t基因的方法。
技術(shù)介紹
1、器官移植是很多終末期器官衰竭患者的有效方法，也是臨床上最常使用的治療方式。異種器官移植是目前公認(rèn)的解決人類器官供需嚴(yán)重不平衡的有效途徑。相比于其他動(dòng)物，豬被認(rèn)為是最適合進(jìn)行異種器官移植的供體動(dòng)物。
2、實(shí)現(xiàn)豬到人的異種器官移植必須解決的問題是豬和人之間免疫學(xué)的不相容性，主要體現(xiàn)為免疫排斥反應(yīng)與凝血障礙。根據(jù)排斥反應(yīng)發(fā)生時(shí)間的先后，免疫排斥分為超急性排斥反應(yīng)（hyperacute?rejection，har）、急性血管排斥反應(yīng)（acute?vascular?rejection，avr）、慢性排斥反應(yīng)（chronic?rejection，cr）。har是由人體內(nèi)天然存在的異源性抗體與豬細(xì)胞表面的特異性α-gal抗原表位相結(jié)合激活補(bǔ)體系統(tǒng)導(dǎo)致的，通常發(fā)生在移植后數(shù)分鐘到數(shù)小時(shí)內(nèi)。avr主要是由于激活的內(nèi)皮細(xì)胞和促炎癥因子募集先天免疫細(xì)胞（自然殺傷細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等）引起的，通常發(fā)生在移植后數(shù)周到數(shù)月。
3、在此發(fā)生過程中，由于促炎癥基因表達(dá)、化學(xué)增活素增加以及血小板活化所導(dǎo)致的凝血障礙，表現(xiàn)為血栓微血管病和彌散性血管內(nèi)凝血。cr主要由t淋巴細(xì)胞引起，通常在移植完成數(shù)年后才會(huì)出現(xiàn)。t淋巴細(xì)胞表面的共刺激分子cd28可與抗原呈遞細(xì)胞apc表面的b7分子結(jié)合，釋放針對t細(xì)胞受體信號傳導(dǎo)復(fù)合物的信號來協(xié)同刺激信號通路和tcr介導(dǎo)的t細(xì)胞激活、增殖以及產(chǎn)生細(xì)胞因子，引起免疫反應(yīng)。
4、在同種
5、在同種移植中，即使擁有abo血型不一致或者受體內(nèi)存在抗供體hla抗體的情況下，移植物在移植后出現(xiàn)的amr也可通過（1）血漿置換；（2）靶向消除b細(xì)胞以及漿細(xì)胞；（3）抑制補(bǔ)體激活；（4）抗炎癥藥物治療對其進(jìn)行緩解甚至逆轉(zhuǎn)。而即便是在移植之前選擇具有低滴度抗3ko豬抗體的nhp受體進(jìn)行移植，移植之后也會(huì)有很大概率出現(xiàn)急性amr，而且有關(guān)異種移植amr的逆轉(zhuǎn)目前還未見報(bào)道。有關(guān)這類抗體是由于預(yù)先形成抗體（pdsa，performeddonor?specific?antibody）再次反彈爆發(fā)還是由于針對移植物表面抗原的新生成的抗體（dndsa，de-novo?donor?specific?antibody）目前還未有明確定論。
6、傳統(tǒng)技術(shù)中異種移植模型豬構(gòu)建策略包含糖抗原表位的消除以及轉(zhuǎn)入人相關(guān)調(diào)節(jié)蛋白，以消除豬與人之間的免疫不相容性。傳統(tǒng)技術(shù)中基因修飾策略基本解決了超急性免疫排斥，對于后續(xù)階段的排斥反應(yīng)作用甚微，尤其是對于器官長期存在會(huì)面臨的抗體介導(dǎo)的免疫排斥反應(yīng)。
7、但目前暫未有在豬細(xì)胞內(nèi)表達(dá)人cd64相關(guān)基因并將其應(yīng)用于異種移植的相關(guān)報(bào)道。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、基于此，本申請一實(shí)施例提供一種工程化細(xì)胞系的構(gòu)建方法及在豬細(xì)胞內(nèi)表達(dá)人cd64t基因的方法。
2、本申請一方面提供一種工程化細(xì)胞系的構(gòu)建方法，包括在豬細(xì)胞的hipp11位點(diǎn)敲入人cd64t基因；
3、所述人cd64t基因的轉(zhuǎn)錄本cd64t的氨基酸序列如seq?id?no.1所示。
4、在其中一個(gè)實(shí)施例中，通過基因編輯的方式在豬細(xì)胞的hipp11位點(diǎn)敲入人cd64t基因。
5、在其中一個(gè)實(shí)施例中，基因編輯的方式包括采用crispr/cas9系統(tǒng)；
6、所述crispr/cas9系統(tǒng)包含用于靶向豬hipp11基因的grna，所述grna的核苷酸序列如seq?id?no.2所示。
7、本申請另一方面提供所述的工程化細(xì)胞系的構(gòu)建方法構(gòu)建得到的工程化細(xì)胞。
8、本申請還提供所述的工程化細(xì)胞在制備降低異種移植免疫排斥藥物中的應(yīng)用。
9、本申請另一方面提供一種在豬細(xì)胞內(nèi)表達(dá)人cd64t基因的方法，所述方法包括：在豬細(xì)胞的hipp11位點(diǎn)敲入人cd64t基因。
10、在其中一個(gè)實(shí)施例中，包括混合所述grna、含有人cd64t基因的donor序列和cas9蛋白，制備混合物；以及，將所述混合物導(dǎo)入豬細(xì)胞。
11、在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述豬細(xì)胞為豬內(nèi)皮細(xì)胞。
12、在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述豬內(nèi)皮細(xì)胞為豬髖動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞。
13、本申請另一方面提供所述的在豬細(xì)胞內(nèi)表達(dá)人cd64t的方法制備得到的表達(dá)人cd64t的豬細(xì)胞在降低異種移植免疫排斥中的應(yīng)用。
本文檔來自技高網(wǎng)...【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.一種工程化細(xì)胞系的構(gòu)建方法，其特征在于，包括在豬細(xì)胞的Hipp11位點(diǎn)敲入人CD64t基因；
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的工程化細(xì)胞系的構(gòu)建方法，其特征在于，通過基因編輯的方式在豬細(xì)胞的Hipp11位點(diǎn)敲入人CD64t基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的工程化細(xì)胞系的構(gòu)建方法，其特征在于，基因編輯的方式包括采用CRISPR/Cas9系統(tǒng)；
4.根據(jù)權(quán)利要求1~3任一項(xiàng)所述的工程化細(xì)胞系的構(gòu)建方法構(gòu)建得到的工程化細(xì)胞。
5.權(quán)利要求4所述的工程化細(xì)胞在制備降低異種移植免疫排斥藥物中的應(yīng)用。
6.一種在豬細(xì)胞內(nèi)表達(dá)人CD64t基因的方法，其特征在于，所述方法包括：
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的在豬細(xì)胞內(nèi)表達(dá)人CD64t基因的方法，其特征在于，包括混合所述gRNA、含有人CD64基因的donor序列和Cas9蛋白，制備混合物；以及，將所述混合物導(dǎo)入豬細(xì)胞；
8.根據(jù)權(quán)利要求5~6任一項(xiàng)所述的在豬細(xì)胞內(nèi)表達(dá)人CD64t基因的方法，其特征在于，所述豬細(xì)胞為豬內(nèi)皮細(xì)胞。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的在豬細(xì)胞內(nèi)
10.權(quán)利要求6~9任一項(xiàng)所述的在豬細(xì)胞內(nèi)表達(dá)人CD64t的方法制備得到的表達(dá)人CD64t的豬細(xì)胞在降低異種移植免疫排斥中的應(yīng)用。
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種工程化細(xì)胞系的構(gòu)建方法，其特征在于，包括在豬細(xì)胞的hipp11位點(diǎn)敲入人cd64t基因；
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的工程化細(xì)胞系的構(gòu)建方法，其特征在于，通過基因編輯的方式在豬細(xì)胞的hipp11位點(diǎn)敲入人cd64t基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的工程化細(xì)胞系的構(gòu)建方法，其特征在于，基因編輯的方式包括采用crispr/cas9系統(tǒng)；
4.根據(jù)權(quán)利要求1~3任一項(xiàng)所述的工程化細(xì)胞系的構(gòu)建方法構(gòu)建得到的工程化細(xì)胞。
5.權(quán)利要求4所述的工程化細(xì)胞在制備降低異種移植免疫排斥藥物中的應(yīng)用。
6.一種在豬細(xì)胞內(nèi)表達(dá)人cd64t基因的方法，其特征在于...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：賴良學(xué)，吳涵，連萌，夏聰，
申請(專利權(quán))人：中國科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院，
類型：發(fā)明
國別省市：
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