【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及生物材料，尤其涉及crgd靶向肽修飾的內皮祖細胞來源仿生納米囊泡的制備方法。
技術介紹
1、血管新生是創面愈合的必要環節。然而，糖尿病創面的內皮細胞功能障礙，導致血管新生減少，是其不愈合的關鍵因素。內皮祖細胞epcs，亦稱為內皮前體細胞，具有強大的旁分泌能力。此前認為，epcs主要通過分泌趨化因子和細胞因子調節內皮細胞功能。近年研究發現，epcs還能通過分泌納米囊泡改善內皮細胞功能，加速糖尿病創面血管新生，可以作為糖尿病創面修復的潛在手段。
2、然而，這類由細胞分泌的天然外泌體在轉化應用時存在明顯缺陷。一是天然外泌體大多產量極低且不穩定，據報道，基于超高速離心的策略僅能從每毫升細胞上清中收獲1-10μg的納米囊泡。二是天然外泌體分離和純化步驟繁瑣、成本高且周期長。三是天然外泌體性能不穩定，親本細胞經多次傳代后所分泌的納米囊泡表型和功能可能發生顯著改變，降低治療潛力。因此，急需解決。
3、上述內容僅用于輔助理解本專利技術的技術方案，并不代表承認上述內容是最接近的現有技術。
技術實現思路
1、本專利技術所要解決的技術問題是提供crgd靶向肽修飾的內皮祖細胞來源仿生納米囊泡的制備方法，該方法提供了一種新穎的具有促血管生成、抗氧化和抗菌的生物遞送系統，提升了治療糖尿病的創面效果。
2、為達到所述目的，本專利技術的技術方案是這樣實現的，crgd靶向肽修飾的內皮祖細胞來源仿生納米囊泡的制備方法，制備方法包括以下步驟：
3、s1、制備
4、s11、進行epcs細胞分離、培養、鑒定，
5、s12、進行epcs-nvs的制備，
6、s13、進行epc-nvs的crgd修飾與鑒定；
7、s2、制備adm-fe3+@pa/gelma水凝膠：
8、s21、在ph值等于10的環境中以1：3的摩爾比合成fe3+@原兒茶醛(protocatechualdehyde，pa)溶液；
9、s22、將合車的fe3+@原兒茶醛溶液與adm混合，進行多次離心洗滌后加入配置好的光固化明膠(gelma)前體溶液；
10、s23、通過超聲空化使搭載fe3+@pa的adm均勻分散；
11、s24、通過416nm藍光光照以及adm自組裝形成雙交聯水凝膠。
12、優選的，所述步驟s11中的epcs細胞分離、培養和鑒定包括從大鼠骨髓細胞懸液中分離出epcs，進行原代細胞培養以及傳代。
13、優選的，所述步驟s12中進行epcs-nvs的制備過程包括：
14、s12a.用含去外泌體血清的培養基培養原代epcs，并收集細胞上清，采用超速離心法提取epcs的天然外泌體；
15、s12b.將500-1000萬/ml的epcs懸液依次通過擠壓器的10μm、5μm、1μm孔膜，去除細胞碎片后，獲取細胞囊泡懸液，再將懸液進行超速離心，獲取epc-nvs。
16、優選的，所述s13中進行epc-nvs的crgd修飾的過程包括：
17、s13a.將deepc-nvs懸浮液與crgd膠束溶液共孵育，尺寸排阻色譜法對crgd修飾的epc-nvs進行純化，獲得crgd@deepc-nvs；
18、s13b.crgd@deepc-nvs的鑒定：進行epcs天然外泌體與epc-nvs的鑒定及比較：透射電子顯微鏡(transmission?electron?microscopy,tem)觀察兩種囊泡的形態和大小；納米流式(nanoparticle?tracking?analysis,nta)和動態光散射(dynamic?lightscattering,dls)檢測兩種囊泡的粒徑大小和分布；western-blot檢測兩種囊泡的特異性膜蛋白，如cd9、cd63和cd81；運用zeta電位檢測膜電位。
19、本專利技術的有益效果體現在：
20、(1)本專利技術通過擠壓的方法制備的內皮祖細胞來源的仿生納米囊泡，可以作為ev模擬物，將epc內容物輸送到傷口。此外，本專利技術將crgd靶向肽偶聯到epc-nv表面，可以實現對內皮細胞(endothelial?cells,ecs)的主動靶向。此外，還提供了一種雙重水凝膠網絡，將fe3+@pa絡合物修飾的adm與光固化明膠(gelma)結合，以富集和緩釋mepc-nv。該水凝膠網絡具有抗氧化和抗菌性能，在糖尿病創面中可以降低活性氧水平并且抑制細菌感染，彌補了epc-nv功能的不足。
21、(2)本專利技術根據糖尿病創面細胞攝取能力低、種類復雜的特點，構建了攝取增強、靶向增強的定制化mepc-nv，首次將crgd靶向肽應用到糖尿病創面上，提升了治療效果。
22、(3)本專利技術構建了adm-fe3+-mnv@pa/gelma靶向遞送系統來協同治療，增強了糖尿病創面的治療效果。
23、(4)本專利技術采用擠壓法可在相同細胞量條件下獲得相對天然外泌體5-100倍的囊泡粒子或蛋白量得率，并避免了繁瑣的細胞擴增和上清液濃縮等步驟。其次，由于產量的大幅提高，獲得等量的納米囊泡無需親本細胞多次傳代，保證了仿生納米囊泡的性能穩定性。
本文檔來自技高網...【技術保護點】
1.cRGD靶向肽修飾的內皮祖細胞來源仿生納米囊泡的制備方法，其特征在于，制備方法包括以下步驟：
2.根據權利要求1所述的cRGD靶向肽修飾的內皮祖細胞來源仿生納米囊泡的制備方法，其特征在于，所述步驟S11中的EPCs細胞分離、培養和鑒定包括：從大鼠骨髓細胞懸液中分離出EPCs，進行原代細胞培養以及傳代。
3.根據權利要求2所述的cRGD靶向肽修飾的內皮祖細胞來源仿生納米囊泡的制備方法，其特征在于，所述步驟S12中進行EPCs-NVs的制備過程包括：
4.根據權利要求3所述的cRGD靶向肽修飾的內皮祖細胞來源仿生納米囊泡的制備方法，其特征在于，所述S13中進行EPC-NVs的cRGD修飾的過程包括：
【技術特征摘要】
1.crgd靶向肽修飾的內皮祖細胞來源仿生納米囊泡的制備方法，其特征在于，制備方法包括以下步驟：
2.根據權利要求1所述的crgd靶向肽修飾的內皮祖細胞來源仿生納米囊泡的制備方法，其特征在于，所述步驟s11中的epcs細胞分離、培養和鑒定包括：從大鼠骨髓細胞懸液中分離出epcs，進行原代細胞培養以及傳代。
【專利技術屬性】
技術研發人員：陳振兵，楊小凡，潘昕巖，劉碩媛，萬歸，
申請(專利權)人：華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院，
類型：發明
國別省市：
還沒有人留言評論。發表了對其他瀏覽者有用的留言會獲得科技券。