【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及細胞，特別涉及一種外周血單個核細胞凍存液及其制備方法和應用、外周血單個核細胞的凍存方法。
技術介紹
1、外周血單個核細胞(peripheral?blood?mononuclear?cell，pbmc)即外周血中具有單個核的細胞。單個核細胞(mononuclear?cell)包括兩種類型細胞，一類是淋巴細胞(lymphocyte)，另一類是單核細胞(monocyte)。臨床上，pbmc是免疫系統的關鍵組成部分，因此在免疫學、傳染病、惡性腫瘤、疫苗研發、移植治療、個性化醫學和毒理學等領域作為最基礎的實驗原料被廣泛使用。同時因pbmc在機體免疫中的重要性，所以pbmc成為很多科研工作者重點關注和研究的對象。
2、細胞凍存是細胞保存的主要手段之一，利用該技術可將細胞放置于-196℃的液氮中低溫保存，細胞將會暫時脫離生長狀態并保持細胞特性保存起來，在需要的時候可將細胞復蘇使用。細胞凍存時可向培養基中加入滲透性保護劑或非滲透性保護劑，在緩慢的凍結條件下可使溶液冰點降低，細胞內水分透出從而減少冰晶的形成，避免細胞損傷。
3、現階段凍存單個核細胞的方法多使用二甲基亞砜(dmso)聯合其他成分對單個核細胞進行凍存，但dmso對細胞具有毒性，復蘇后移除不及時會損傷細胞降低細胞的活性，同時長期接觸或高濃度會對細胞產生不利影響。當然也有不含dmso和培養基等的凍存液，但是其價格昂貴，不適用于大批量生產使用。
技術實現思路
1、本專利技術的主要目的是提出一種外周血單個核
2、為實現上述目的，本專利技術提出一種外周血單個核細胞凍存液，所述外周血單個核細胞凍存液用于凍存外周血單個核細胞，所述外周血單個核細胞凍存液包括以下組分：滲透性保護劑、非滲透性保護劑，人血白蛋白、1640基礎培養基、谷胱甘肽、自體血漿、維生素c及肝素鈉；
3、其中，所述自體血漿為所述外周血單個核細胞的血漿。
4、在一實施例中，按質量份數計，所述外周血單個核細胞凍存液包括以下組分：
5、8～10份滲透性保護劑、14～16份非滲透性保護劑、2～4份人血白蛋白、50～70份1640基礎培養基、0.5～1份谷胱甘肽、14～16份自體血漿及0.1～0.5份維生素c；
6、所述外周血單個核細胞凍存液中，肝素鈉的濃度為4～6iu/ml。
7、在一實施例中，所述滲透性保護劑包括甘油和乙酰胺中的至少一種。
8、在一實施例中，所述滲透性保護劑包括甘油和乙酰胺，甘油與乙酰胺的質量比為(5～8)：(1～5)。
9、在一實施例中，所述非滲透性保護劑包括聚乙二醇、海藻糖、葡萄糖及右旋糖酐中的至少一種。
10、在一實施例中，所述非滲透性保護劑包括聚乙二醇、海藻糖、葡萄糖及右旋糖酐，聚乙二醇、海藻糖、葡萄糖及右旋糖酐的質量比為(2～4)：5：2：2：3。
11、本專利技術還提出一種外周血單個核細胞凍存液的制備方法，包括：
12、s10.獲取外周血樣本和人體淋巴分離液，將外周血平鋪在人體淋巴分離液上離心，取上清液離心，得自體血漿；
13、s20.將滲透性保護劑、非滲透性保護劑，人血白蛋白、1640基礎培養基、谷胱甘肽、自體血漿、維生素c及肝素鈉混合，得外周血單個核細胞凍存液。
14、本專利技術還提出一種外周血單個核細胞凍存液在凍存外周血單個核細胞中的應用，所述外周血單個核細胞凍存液包括如前述的外周血單個核細胞凍存液，或，按如前述的制備方法制備得到的外周血單個核細胞凍存液。
15、本專利技術還提出一種外周血單個核細胞的凍存方法，包括：
16、s100.獲取待凍存的外周血單個核細胞，用生理鹽水將外周血單個核細胞重懸，得待凍存的細胞混懸液；
17、s200.將待凍存的細胞混懸液與外周血單個核細胞凍存液混合，置于-80℃下預冷凍，再置于-200～-190℃液氮中保存，其中，所述外周血單個核細胞凍存液包括如前述的外周血單個核細胞凍存液。
18、在一實施例中，步驟s200中，混合后，外周血單個核細胞的密度為1.0～2.0×107cells/ml。
19、本專利技術的技術方案中，通過采用滲透性保護劑和非滲透性保護劑相結合，同時又加入人血白蛋白、1640基礎培養基、肝素鈉、谷胱甘肽、自體血漿和維生素c，既提供了細胞冷凍保存過程中代謝環境又保證了細胞復蘇后的活率和增殖活力；其中，滲透性保護劑可以進入細胞內與水分子結合減少冰晶的形成，同時還能減少細胞內水分的過分外滲，避免細胞因過分脫水而皺縮，從而對細胞進行保護作用；非滲透性保護劑能后可以提高溶劑的粘度和凝固點，從而減少冰晶的形成，當細胞外液結冰時，體積會膨脹。非滲透性冷凍保護劑能夠填充細胞周圍的空隙，減少因水分凍結而導致的空間變化，從而減輕對細胞膜的壓力以及由此引起的機械性損傷，并且非滲透性保護劑可維持細胞外環境的穩定，同時還能防止蛋白質在凍融過程中的聚變和變性從而保護細胞內外的蛋白質成分。
本文檔來自技高網...【技術保護點】
1.一種外周血單個核細胞凍存液，其特征在于，所述外周血單個核細胞凍存液用于凍存外周血單個核細胞，所述外周血單個核細胞凍存液包括以下組分：滲透性保護劑、非滲透性保護劑，人血白蛋白、1640基礎培養基、谷胱甘肽、自體血漿、維生素C及肝素鈉；
2.如權利要求1所述的外周血單個核細胞凍存液，其特征在于，按質量份數計，所述外周血單個核細胞凍存液包括以下組分：
3.如權利要求1所述的外周血單個核細胞凍存液，其特征在于，所述滲透性保護劑包括甘油和乙酰胺中的至少一種。
4.如權利要求3所述的外周血單個核細胞凍存液，其特征在于，所述滲透性保護劑包括甘油和乙酰胺，甘油與乙酰胺的質量比為(5～8)：(1～5)。
5.如權利要求1所述的外周血單個核細胞凍存液，其特征在于，所述非滲透性保護劑包括聚乙二醇、海藻糖、葡萄糖及右旋糖酐中的至少一種。
6.如權利要求4所述的外周血單個核細胞凍存液，其特征在于，所述非滲透性保護劑包括聚乙二醇、海藻糖、葡萄糖及右旋糖酐，聚乙二醇、海藻糖、葡萄糖及右旋糖酐的質量比為(2～4)：5：2：2：3。
7.
8.一種外周血單個核細胞凍存液在凍存外周血單個核細胞中的應用，其特征在于，所述外周血單個核細胞凍存液包括如權利要求1至6任一項所述的外周血單個核細胞凍存液，或，按如權利要求7所述的制備方法制備得到的外周血單個核細胞凍存液。
9.一種外周血單個核細胞的凍存方法，其特征在于，包括：
10.如權利要求9所述的外周血單個核細胞的凍存方法，其特征在于，步驟S200中，混合后，外周血單個核細胞的密度為1.0～2.0×107cells/ml。
...【技術特征摘要】
1.一種外周血單個核細胞凍存液，其特征在于，所述外周血單個核細胞凍存液用于凍存外周血單個核細胞，所述外周血單個核細胞凍存液包括以下組分：滲透性保護劑、非滲透性保護劑，人血白蛋白、1640基礎培養基、谷胱甘肽、自體血漿、維生素c及肝素鈉；
2.如權利要求1所述的外周血單個核細胞凍存液，其特征在于，按質量份數計，所述外周血單個核細胞凍存液包括以下組分：
3.如權利要求1所述的外周血單個核細胞凍存液，其特征在于，所述滲透性保護劑包括甘油和乙酰胺中的至少一種。
4.如權利要求3所述的外周血單個核細胞凍存液，其特征在于，所述滲透性保護劑包括甘油和乙酰胺，甘油與乙酰胺的質量比為(5～8)：(1～5)。
5.如權利要求1所述的外周血單個核細胞凍存液，其特征在于，所述非滲透性保護劑包括聚乙二醇、海藻糖、葡萄糖及右旋糖酐...
【專利技術屬性】
技術研發人員：智曉瑩，王麗，范波鱗，姚夢薇，崔奎琰，馮晨晨，尹立東，劉瑩，
申請(專利權)人：深圳市邁科龍生物技術有限公司，
類型：發明
國別省市：
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