【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于酶工程和基因工程，具體涉及一種重組ω-轉氨酶催化劑、其編碼基因及其在催化合成環己胺中的應用。
技術介紹
1、伯胺是一種常見且廣泛使用的平臺分子，在化工生產和生命科學領域都有很大的應用價值。環己胺作為伯胺的代表物質之一，在化工生產、醫藥、食品加工等領域有很大的需求量。環己胺是很多藥物合成中的關鍵中間體，如一種抗癌藥物“reversine”[1，2-(4-嗎啉苯胺基?)-n6?-環己基腺嘌呤]；環己胺的磺酸鹽，是一種常見且廉價的甜蜜素，廣泛應用與食品添加劑。隨著環己胺的下游產品的不斷開發，市場上對環己胺的需求量也在日益升高，而目前對環己胺的生產主要以硝基苯為原料還原氫化為主，條件苛刻，副產物難以處理，對環境污染嚴重，不符合綠色環保理念。
2、由于酶催化反應條件溫和、選擇性高且對環境友好，因此綠色酶法合成環己胺是未來工業的大趨勢。依賴于輔酶磷酸吡哆醛的ω-轉氨酶具有高選擇性，寬底物譜等優良性質，成為最具吸引力的酶催化劑。但由于目前大多數野生型ω-轉氨酶在底物特異性、穩定性、催化效率等方面存在諸多不足，無法滿足工業應用需求。因此，發現和改造高效的、開發穩定的、成本低廉的轉氨酶用于催化生產環己胺，對于推動環己胺的在國內市場的發展有重大意義。
技術實現思路
1、本專利技術的目的是提供一種重組ω-轉氨酶催化劑、其編碼基因及其在催化合成環己胺中的應用，該催化劑催化合成一種高附加值的環己胺。
2、本專利技術由如下技術方案實現的：一種重組ω-轉氨酶催化劑，其氨基酸
3、本專利技術還提供了一種重組ω-轉氨酶基因，該基因編碼所述的重組ω-轉氨酶催化劑。
4、進一步的，其核苷酸序列如seq?id?no：2所示。
5、本專利技術還提供了包含所述重組ω-轉氨酶基因的重組載體。
6、進一步的，所述載體為大腸桿菌表達載體。
7、更進一步的，所述表達載體為pet-28a、pet-29a、pet-30a、pet-32a、pcold?i或pcold?ii中的任意一種。
8、本專利技術還提供了包含所述重組載體的重組宿主細胞，所述宿主細胞為bl21(de3)，bl21?star(de3)，bl21?(de3)?plyss，c41(de3)，c43(de3)，bl21?(de3)?plyse，origami系列、ad494?(de3)、bl21?trxb?(de3)?、shuffle?t7中的任意一種。
9、本專利技術另外還提供了包含所述重組ω-轉氨酶的酶制劑，所述酶制劑為粗酶液、粗酶粉或純酶；由如下方法制備而成：在宿主細胞中表達所述ω-轉氨酶，得到重組細胞；裂解重組細胞獲得粗酶液、粗酶粉或純酶。
10、本專利技術所述重組ω-轉氨酶催化劑在催化環己酮生成環己胺中的應用。
11、具體方法為：氨基供體為苯乙胺，氨基受體為環己酮，在所述的酶制劑和輔酶磷酸吡哆醛的催化下生成環己胺和副產物苯乙酮，反應溫度為35℃，ph=8.5的100?mmol/l的三乙醇胺緩沖液。
12、本專利技術選擇來源于惡臭假單胞桿菌屬（ pseudomonas?putida）的野生蛋白序列，通過人工設計和密碼子優化，利用基因合成技術獲得編碼ω-轉氨酶的核苷酸序列，其核苷酸序列如seq?id?no：2所示。
13、本專利技術還提供包含所述核苷酸序列的重組表達載體。如本領域中的常規質粒（pet系列），優選的為pet-28a。在載體上通過酶切、連接等分子生物學操作，將所述核苷酸序列插入到pet-28a中，構建得到重組表達質粒，命名為pet28a-ω-ta。
14、本專利技術還提供了包含所述重組表達載體的重組宿主細胞。優選大腸桿菌 e? .colibl21(de3)。將本專利技術第二方面中所述的重組表達質粒pet28a-ta轉化至 e?.colibl21(de3)中，獲得相應的基因工程菌 e?.colibl21?(de3)?pet28a-ta。
15、本專利技術還提供了所述ω-轉氨酶催化劑的制備方法。游離蛋白催化劑是將全細胞經超聲破碎并通過離心后獲得的粗酶液，亦包括通過蛋白純化手段獲得的純酶，亦包括由粗酶液經干燥獲得的粗酶粉。
16、本專利技術還提供了所述的轉氨酶在制備環己胺的應用。化合物的結構式如圖4所示，所述應用包括用于合成治療癌癥等關鍵醫藥中間體、食品添加劑及其各種化工合成原料。
17、本專利技術所獲得的重組轉氨酶催化劑能夠催化環己酮合成環己胺，與環己酮具有高親和力、催化效率高，改催化劑的比活力(790u/mg)比已報道的高。
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1.一種重組ω-轉氨酶催化劑，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ?ID?NO：1所示。
2.一種重組ω-轉氨酶基因，其特征在于：編碼權利要求1所述的重組ω-轉氨酶催化劑。
3.根據權利要求2所述的重組ω-轉氨酶基因，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ?IDNO：2所示。
4.包含權利要求2或3所述重組ω-轉氨酶基因的重組載體，其特征在于：所述載體為大腸桿菌表達載體。
5.根據權利要求4所述的重組載體，其特征在于：所述表達載體為pET-28a、pET-29a、pET-30a、pET-32a、pCold?I或pCold?II中的任意一種。
6.根據權利要求5所述的重組載體，其特征在于：所述表達載體為pET-28a。
7.包含權利要求4所述重組載體的重組宿主細胞，其特征在于：所述宿主細胞為BL21(DE3)，BL21?Star(DE3)，BL21?(DE3)?pLysS，C41(DE3)，C43(DE3)，BL21?(DE3)?pLysE，Origami系列、AD494?(DE3)、BL21?Trxb?(DE3)?、S
8.根據權利要求7所述的包含重組載體的重組宿主細胞，其特征在于：所述宿主細胞為E?.coli?BL21(DE3)。
9.包含權利要求1所述重組ω-轉氨酶的酶制劑，其特征在于：所述酶制劑為粗酶液、粗酶粉或純酶；由如下方法制備而成：在宿主細胞中表達所述ω-轉氨酶，得到重組細胞；裂解重組細胞獲得粗酶液、粗酶粉或純酶。
10.權利要求1所述重組ω-轉氨酶催化劑在催化環己酮生成環己胺中的應用，其特征在于：具體方法為：氨基供體為苯乙胺，氨基受體為環己酮，在重組ω-轉氨酶和輔酶磷酸吡哆醛的催化下生成環己胺和副產物苯乙酮，反應溫度為35℃，pH=8.5的100?mmol/L的三乙醇胺緩沖液。
...【技術特征摘要】
1.一種重組ω-轉氨酶催化劑，其特征在于：其氨基酸序列如seq?id?no：1所示。
2.一種重組ω-轉氨酶基因，其特征在于：編碼權利要求1所述的重組ω-轉氨酶催化劑。
3.根據權利要求2所述的重組ω-轉氨酶基因，其特征在于：其核苷酸序列如seq?idno：2所示。
4.包含權利要求2或3所述重組ω-轉氨酶基因的重組載體，其特征在于：所述載體為大腸桿菌表達載體。
5.根據權利要求4所述的重組載體，其特征在于：所述表達載體為pet-28a、pet-29a、pet-30a、pet-32a、pcold?i或pcold?ii中的任意一種。
6.根據權利要求5所述的重組載體，其特征在于：所述表達載體為pet-28a。
7.包含權利要求4所述重組載體的重組宿主細胞，其特征在于：所述宿主細胞為bl21(de3)，bl21?star(de3)，bl21?(d...
【專利技術屬性】
技術研發人員：盧靜，石亞偉，李帥，魏春華，劉青山，劉雨婷，
申請(專利權)人：山西大學，
類型：發明
國別省市：
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