【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及一種產n-乙酰神經氨酸的重組大腸桿菌及其構建方法和應用，屬于基因工程。
技術介紹
1、n-乙酰神經氨酸(n-acetylneuraminic?acid)是一種功能性單糖，具有非常重要的應用價值。在人體中，n-乙酰神經氨酸參與細胞間信號轉導、識別等重要生理過程，因此，n-乙酰神經氨酸被廣泛應用于促進適齡嬰兒大腦發育，維持老年人大腦功能和健康，抗流感病毒，增強免疫力等方面。目前，天然提取法、酶催化法和全細胞催化法是neuac的主要工業生產方法，但是存在高成本、造成環境污染等問題。而隨著合成生物學和代謝工程的發展，分析并調控微生物體內的代謝途徑以實現目標產物的高效累積已成為現實且易于操作。作為更加綠色高效可持續的方法，微生物發酵法用于從頭合成neuac具有很大優勢，是一種更有前景的合成策略。
2、大腸桿菌是工業上常用的底盤微生物細胞，具有培養簡單，遺傳操作簡便等優點，已被大范圍應用于各種有用的化合物合成。此外，大腸桿菌在代謝工程中已經具備功能完備的遺傳工具，原料發酵工藝也較為成熟，成本較低，因此以大腸桿菌為宿主，通過代謝工程改造，以葡萄糖等廉價碳源為底物，高效從頭合成n-乙酰神經氨酸是一種有效的策略。
3、目前在大腸桿菌中生產n-乙酰神經氨酸以emp途徑作為糖酵解途徑，存在磷酸烯醇式丙酮酸(pep)供應不足的問題。從emp途徑生產丙酮酸步驟較多，碳源的中間過程損耗較大，限制了n-乙酰神經氨酸產量的進一步提高。因此減少中間代謝過程，降低碳源損耗率，提高pep供給十分重要。
1、為解決上述問題，本專利技術首先通過對基因組的三步組合改造和啟動子優化實現了葡萄糖和甘油雙碳源生產n-乙酰神經氨酸，而且大大降低了副產物乙酸的生成，其次在菌株中構建ed途徑為主要糖酵解途徑，通過4步反應即可實現emp途徑10步反應供應前體物丙酮酸，減少中間步驟，具有更低的蛋白代謝負擔，可以減少碳源損耗，丙酮酸的快速供給可以促進其轉化成為pep，應對了生長過程中pep供給不足的問題，實現了n-乙酰神經氨酸的高效合成。
2、本專利技術的第一個目的是提供一種重組大腸桿菌，所述重組大腸桿菌包括以下改造：
3、敲除6-磷酸果糖激酶編碼基因pfka、6-磷酸果糖激酶編碼基因pfkb和甘油激酶編碼基因(glpk)，過表達甘油激酶突變體編碼基因(glpk22)，敲除pts磷酸轉移酶i編碼基因(ptsi)并在該位點整合表達葡萄糖促進擴散轉運蛋白編碼基因(glf)，在基因組上整合表達含有6-pg脫水酶編碼基因(edd)和kdpg醛縮酶編碼基因(eda)的表達框且至少一個拷貝整合在基因ymgf位點；
4、所述葡萄糖促進擴散轉運蛋白編碼基因由核苷酸序列如seq?id?no.10所示的啟動子啟動表達，所述甘油激酶突變體的氨基酸序列如seq?id?no.1所示。
5、進一步地，整合表達兩個拷貝的含有6-pg脫水酶編碼基因和kdpg醛縮酶編碼基因的表達框，整合位點分別位于etta基因末端和ymgf基因末端。
6、進一步地，etta基因的geneid為948909；ymgf基因的geneid為1450253。
7、進一步地，所述含有6-pg脫水酶編碼基因和kdpg醛縮酶編碼基因的表達框中還包括啟動子和/或調控原件rbs，啟動子包括但不限于t7啟動子，調控原件rbs包括但不限于seq?id?no.16-21所示的序列。優選地，調控6-pg脫水酶編碼基因的rbs為seq?id?no.18所示的序列，調控kdpg醛縮酶編碼基因的rbs為seq?id?no.20所示的序列。
8、進一步地，所述過表達為整合表達和/或游離表達。優選地，敲除甘油激酶編碼基因并在該位點整合表達甘油激酶突變體編碼基因。本專利技術中所用啟動子為glpk原位啟動子。
9、進一步地，所述重組大腸桿菌的宿主菌包括大腸桿菌
10、bl21(de3)δchew::p6-glmsa,overexpression?ofneuc?gene?in?thetemminator?locus?ofpspg?gene?under?the?control?ofpromoter?pl,δmota::p1-glmm-p4-glmuglmsa,overexpression?ofnemneub?gene?in?the?terminator?locus?ofyahogene?under?the?control?ofpromoter?pl,δwecbδmanaδpyka,δnagδnanateδmanxyz。
11、進一步地，所述6-磷酸果糖激酶編碼基因pfka的geneid為948412；所述6-磷酸果糖激酶編碼基因pfkb的geneid為946230；所述甘油激酶編碼基因的geneid為948423；所述pts磷酸轉移酶i編碼基因的gene?id為946879；所述葡萄糖促進擴散轉運蛋白的氨基酸序列如seq?id?no.3所示；所述6-pg脫水酶的氨基酸序列如seq?id?no.11所示；所述kdpg醛縮酶的氨基酸序列如seq?id?no.13所示；
12、所述甘油激酶突變體編碼基因的核苷酸序列如seq?id?no.2所示；所述葡萄糖促進擴散轉運蛋白編碼基因的核苷酸序列如seq?id?no.4所示；所述6-pg脫水酶的核苷酸序列如seq?id?no.12所示；所述kdpg醛縮酶的核苷酸序列如seq?id?no.14所示。
13、本專利技術的第二個目的是提供所述重組大腸桿菌的構建方法，包括以下步驟：
14、以大腸桿菌bl21(de3)δchew::p6-glmsa,overexpression?ofneuc?gene?in?thetemminator?locus?ofpspg?gene?under?the?control?ofpromoter?pl,δmota::p1-glmm-p4-glmuglmsa,overexpression?ofnemneub?gene?in?the?terminator?locus?ofyahogene?under?the?control?ofpromoter?pl,δwecbδmanaδpyka,δnagδnanateδmanxyz為宿主菌，敲除6-磷酸果糖激酶編碼基因pfka、6-磷酸果糖激酶編碼基因pfkb和甘油激酶編碼基因(glpk)，在基因組上整合氨基酸序列如seq?id?no.1所示的甘油激酶突變體編碼基因(glpk22)，敲除pts磷酸轉移酶i編碼基因(ptsi)并以同源重組方式在該位點整合含有seq?id?no.10所示啟動子的葡萄糖促進擴散轉運蛋白編碼基因(glf)表達框，以同源重組方式分別在ymgf位點和etta位點分別整合一個拷貝的同時含有6-pg脫水酶編碼基因和kdpg醛縮酶編碼基因的表達框。
15、本專利技術的第三個目的是提供所述重組大腸桿菌在制備n-乙酰神經氨酸或其衍生產品中的應用。
16、本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種重組大腸桿菌，其特征在于，所述重組大腸桿菌包括以下改造：
2.根據權利要求1所述的重組大腸桿菌，其特征在于，至少包含以下特征中的一項：
3.根據權利要求2所述的重組大腸桿菌，其特征在于，至少包含以下特征中的一項：
4.根據權利要求1所述的重組大腸桿菌，其特征在于，所述含有6-PG脫水酶編碼基因和KDPG醛縮酶編碼基因的表達框中還包括啟動子和/或調控原件RBS；
5.根據權利要求1所述的重組大腸桿菌，其特征在于，所述6-磷酸果糖激酶編碼基因pfkA的GeneID為948412；所述6-磷酸果糖激酶編碼基因pfkB的GeneID為946230；所述甘油激酶編碼基因的GeneID為948423；所述PTS磷酸轉移酶I編碼基因的Gene?ID為946879；所述葡萄糖促進擴散轉運蛋白的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.3所示；所述6-PG脫水酶的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.11所示；所述KDPG醛縮酶的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.13所示；
6.一種重組大腸桿菌的構建方法，其特征在于，包括以下步驟：
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8.一種N-乙酰神經氨酸的生產方法，其特征在于，包括采用權利要求1-5任一項所述重組大腸桿菌或權利要求6所述構建方法得到的重組大腸桿菌進行發酵生產的步驟。
9.根據權利要求8所述的生產方法，其特征在于，所述發酵生產包括以復合碳源進行發酵，所述復合碳源中含有葡萄糖和甘油。
10.根據權利要求9所述的生產方法，其特征在于，至少包含以下特征中的一項：
...【技術特征摘要】
1.一種重組大腸桿菌，其特征在于，所述重組大腸桿菌包括以下改造：
2.根據權利要求1所述的重組大腸桿菌，其特征在于，至少包含以下特征中的一項：
3.根據權利要求2所述的重組大腸桿菌，其特征在于，至少包含以下特征中的一項：
4.根據權利要求1所述的重組大腸桿菌，其特征在于，所述含有6-pg脫水酶編碼基因和kdpg醛縮酶編碼基因的表達框中還包括啟動子和/或調控原件rbs；
5.根據權利要求1所述的重組大腸桿菌，其特征在于，所述6-磷酸果糖激酶編碼基因pfka的geneid為948412；所述6-磷酸果糖激酶編碼基因pfkb的geneid為946230；所述甘油激酶編碼基因的geneid為948423；所述pts磷酸轉移酶i編碼基因的gene?id為946879；所述葡萄糖促進擴散轉運蛋白的氨基酸序列...
【專利技術屬性】
技術研發人員：劉延峰，陳堅，堵國成，李江華，劉龍，武耀康，呂雪芹，周雨桑，
申請(專利權)人：江南大學，
類型：發明
國別省市：
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