【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】
本專利技術涉及重組蛋白質產生領域。本專利技術提供了用于產生cd39及其變體的方法，其中宿主細胞蛋白的水平降低，這會干擾cd39及其變體的純化。使用靶向宿主細胞蛋白的人工mirna來減少干擾宿主細胞蛋白的產生。
技術介紹
1、用于產生分泌性蛋白質的重組細胞系的生成需要將dna載體轉染到宿主細胞中，并使用選擇標記物來富集穩定的轉染子。分泌性蛋白質可能影響細胞參數，例如生長、活力和/或生產力，這通常需要細胞系工程化方法來實現高表達的穩定細胞系。
2、同樣，分泌性重組蛋白質的質量會受到細胞衍生內因子的影響。通常，內源性表達的蛋白質，例如細胞表面受體、酶或蛋白酶(宿主細胞蛋白，即hcp)，可以被鑒定為影響重組蛋白質質量的不期望作用的根本原因(參見例如wo?2014/097113?a2)。另外，宿主細胞蛋白是熟知的生物制品的工藝相關雜質。當存在于藥物產品中時，由于藥物免疫原性、炎癥和其他與特定的殘留宿主細胞蛋白功能相關的活性增加，這些雜質可能引起不良作用(vanderlaan等人,2018,biotechnology?progress[生物技術進展]34,828–837)。存在于制造工藝的多個步驟中和最終藥物物質中的hcp的組成和豐度取決于許多因素。這些因素可能很難先驗預測，并且通常只能通過在工藝開發期間的測試來了解。
3、相應的不期望作用包括重組蛋白質的多肽鏈的酶促切割，例如整個蛋白質的消化或氨基酸剪切，即從目的蛋白質的n或c末端去除一個或幾個氨基酸。其他作用是不需要的翻譯后修飾或去除所需的修飾。此外，宿主細胞的內
4、因此，宿主細胞的內源性基因產物可能顯著地對目的蛋白質的重組產生進行干擾。鑒于上述情況，本領域需要提供策略來減少宿主細胞蛋白對目的蛋白重組產生的不利影響。
技術實現思路
1、本專利技術人旨在提供一種用于在cho細胞中產生的人cd39及其變體，尤其是其中膜錨序列缺失的cd39的可溶性變體的純化方法。在純化方法的開發期間，ccl2被鑒定為具有與cd39變體高度相似的理化性質的宿主細胞蛋白，因此在純化步驟期間沒有顯著地去除。因此，本專利技術人建立了cd39變體的產生細胞系，其中通過使用針對此宿主細胞蛋白的mirna來降低ccl2水平。因此，最終cd39變體的純度可以顯著改善。
2、鑒于此，在第一方面，本專利技術涉及一種產生cd39或其變體的方法，該方法包括以下步驟：
3、(a)提供能夠產生cd39或其變體的cho細胞；
4、(b)在允許產生cd39或其變體的條件下，在細胞培養物中培養cho細胞；
5、(c)從細胞培養物中獲得cd39或其變體；以及
6、(d)任選地加工cd39或其變體；
7、其中將cho細胞工程化以減少cho細胞中ccl2的產生。
8、在第二方面，本專利技術提供了一種cho細胞，該cho細胞能夠產生cd39或其變體，并且將該cho細胞工程化以減少cho細胞中ccl2的產生。
9、在上述方面的某些實施例中，cho細胞產生靶向ccl2的mirna。特別地，通過引入根據第五方面所述的載體核酸將cho細胞工程化。在上述方面的另外的實施例中，通過敲除ccl2基因將cho細胞工程化。
10、在第三方面，本專利技術提供了一種改善在cho細胞中產生cd39或其變體的方法，該方法包括以下步驟：
11、(a-i)提供能夠產生cd39或其變體的cho細胞；
12、(a-ii)將cho細胞工程化以減少cho細胞中ccl2的產生。
13、在某些實施例中，將cho細胞工程化以減少ccl2產生的步驟(a-ii)包括將根據第五方面所述的載體核酸引入cho細胞。
14、在第四方面，本專利技術提供了一種用于在cho細胞中表達mirna的表達盒，該表達盒包含pri-mirna的模板序列，其中該pri-mirna適合于在cho細胞中進行加工以形成靶向ccl2的mirna。
15、在第五方面，本專利技術提供了一種用于轉染cho細胞的載體核酸，該載體核酸包含根據第四方面所述的表達盒。
16、在第六方面，本專利技術提供了一種用于產生能夠表達cd39或其變體的cho細胞的方法，該方法包括將根據第五方面所述的載體核酸引入cho細胞。該載體核酸可以另外地包含編碼cd39或其變體的編碼序列，或另一種包含編碼cd39或其變體的編碼序列的核酸存在于cho細胞中或被引入cho細胞中。
17、在第七方面，本專利技術提供了一種組合物，該組合物包含cd39或其變體以及ccl2，其中該組合物通過使用根據第二方面所述的cho細胞產生來獲得，并且其中
18、(i)與通過使用未被工程化以減少cho細胞中ccl2產生的cho細胞產生來獲得的相同的組合物相比，該組合物中ccl2的量至少低10倍；并且/或者
19、(ii)該組合物包含濃度為100ppm或更低、優選地25ppm或更低、更優選地10ppm或更低的ccl2。
20、在第八方面，本專利技術提供了一種cho細胞，將該cho細胞工程化以減少cho細胞中ccl2的產生。在某些實施例中，cho細胞產生靶向ccl2的mirna。特別地，通過引入根據第五方面所述的載體核酸將cho細胞工程化。在上述方面的另外的實施例中，通過敲除ccl2基因將cho細胞工程化。
21、從以下描述和所附權利要求，本專利技術的其他目的、特征、優點和方面對于本領域的技術人員而言將變得顯而易見。然而，應理解，以下描述、所附權利要求和指示本申請優選實施例的特別實例僅以說明的方式給出。通過閱讀以下內容，在所披露專利技術的精神和范圍內的各種變化和修改對于本領域的技術人員而言將變得顯而易見。
22、定義
23、如本文所用，以下表述通常意在優選地具有如下文所述的含義，除非在使用它們的上下文中另有指示。
24、除了其字面含義之外，如本文所用的表述“包含(comprise)”還包括并且特別是指表述“基本上由……組成”和“由……組成”。因此，表述“包含”是指其中“包含”特別列出的元素的主題不包含另外元素的實施例，以及其中“包含”特別列出的元素的主題可能和/或確實涵蓋另外元素的實施例。同樣，表述“具有”應理解為表述“包含”，還包括并且特別是指表述“基本上由……組成”和“由……組成”。在可能的情況下，術語“基本上由……組成”特別地是指其中除了主題基本上本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種產生CD39或其變體的方法，所述方法包括以下步驟：
2.根據權利要求1所述的方法，其中通過敲低或敲除CCL2表達或降解CCL2蛋白來減少所述CHO細胞中CCL2的產生。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其中將所述CHO細胞工程化以產生靶向所述CHO細胞的內源性CCL2的miRNA，其中所述靶向CCL2的miRNA優選地具有選自由SEQ?ID?NO:26和28組成的組的核苷酸序列。
4.根據權利要求3所述的方法，其中所述CHO細胞包含用于產生所述靶向CCL2的miRNA的表達盒，其中所述表達盒包含內含子序列，所述內含子序列包含pri-miRNA的模板序列，其中所述pri-miRNA適合于在所述CHO細胞中進行加工以形成所述靶向CCL2的miRNA。
5.根據權利要求4所述的方法，其中所述pri-miRNA從5'至3'包含：
6.根據權利要求1至5中任一項所述的方法，其中所述方法用于產生CD39的變體，所述變體具有一個或多個以下特征：
7.根據權利要求1至6中任一項所述的方法，其中在步驟(c)后獲得的C
8.根據權利要求1至7中任一項所述的方法，其中步驟(c)包括：
9.根據權利要求8所述的方法，其中在步驟(c1)后獲得的CD39或其變體存在于組合物中，所述組合物與使用未被工程化以減少CHO細胞中CCL2產生的CHO細胞的步驟(c1)后用相同方法獲得的組合物相比，包含濃度為100ppm或更低，優選地25ppm或更低，更優選地10ppm或更低的CCL2，并且/或者所述組合物包含濃度至少低10倍，優選地低25倍，更優選地低100倍的CCL2；并且/或者其中在步驟(c4)后獲得的CD39或其變體存在于組合物中，所述組合物與使用未被工程化以減少CHO細胞中CCL2產生的CHO細胞的步驟(c4)后用相同方法獲得的組合物相比，包含濃度為25ppm或更低，優選地10ppm或更低，更優選地5ppm或更低的CCL2，并且/或者所述組合物包含濃度至少低10倍，優選地低25倍，更優選地低100倍的CCL2。
10.根據權利要求1至9中任一項所述的方法，其中步驟(d)包括提供包含CD39或其變體的藥物配制品。
11.一種CHO細胞，所述CHO細胞能夠產生CD39或其變體，并且將所述CHO細胞工程化以減少所述CHO細胞中CCL2的產生。
12.根據權利要求11所述的CHO細胞，其中根據權利要求2至7中任一項所限定的將所述CHO細胞工程化以減少所述CHO細胞中CCL2的產生。
13.一種改善在CHO細胞中產生CD39或其變體的方法，所述方法包括以下步驟：
14.根據權利要求13所述的方法，其中根據權利要求2至7中任一項所限定的在步驟(a-ii)中將所述CHO細胞工程化。
15.根據權利要求13或14所述的方法，其中步驟(a-ii)包括將載體核酸引入所述CHO細胞，其中所述載體核酸包含用于表達靶向CCL2的miRNA的表達盒。
16.根據權利要求13至15中任一項所述的方法，其中與在步驟(a-ii)之前相同的CHO細胞相比，工程化所述CHO細胞將所述CHO細胞中的CCL2?mRNA水平和/或CCL2蛋白水平降低至少5倍，優選地至少10倍，更優選地至少25倍。
17.根據權利要求13至16中任一項所述的方法，其中所述方法進一步包括以下步驟：
18.根據權利要求17所述的方法，其中步驟(c)包括：
19.一種用于在CHO細胞中表達miRNA的表達盒，該表達盒包含pri-miRNA的模板序列，其中所述pri-miRNA適合于在CHO細胞中進行加工以形成靶向CCL2的miRNA。
20.根據權利要求19所述的表達盒，所述表達盒具有根據權利要求3至5中任一項所限定的特征。...
【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】
1.一種產生cd39或其變體的方法，所述方法包括以下步驟：
2.根據權利要求1所述的方法，其中通過敲低或敲除ccl2表達或降解ccl2蛋白來減少所述cho細胞中ccl2的產生。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其中將所述cho細胞工程化以產生靶向所述cho細胞的內源性ccl2的mirna，其中所述靶向ccl2的mirna優選地具有選自由seq?id?no:26和28組成的組的核苷酸序列。
4.根據權利要求3所述的方法，其中所述cho細胞包含用于產生所述靶向ccl2的mirna的表達盒，其中所述表達盒包含內含子序列，所述內含子序列包含pri-mirna的模板序列，其中所述pri-mirna適合于在所述cho細胞中進行加工以形成所述靶向ccl2的mirna。
5.根據權利要求4所述的方法，其中所述pri-mirna從5'至3'包含：
6.根據權利要求1至5中任一項所述的方法，其中所述方法用于產生cd39的變體，所述變體具有一個或多個以下特征：
7.根據權利要求1至6中任一項所述的方法，其中在步驟(c)后獲得的cd39或其變體存在于組合物中，所述組合物與使用未被工程化以減少cho細胞中ccl2產生的cho細胞的步驟(c)后用相同方法獲得的組合物相比，包含濃度為100ppm或更低，優選地25ppm或更低，更優選地10ppm或更低的ccl2，并且/或者所述組合物包含濃度至少低10倍，優選地低25倍，更優選地低100倍的ccl2，并且/或者其中步驟(d)后獲得的cd39或其變體存在于組合物中，所述組合物與使用未被工程化以減少cho細胞中ccl2產生的cho細胞的步驟(d)后用相同方法獲得的組合物相比，包含濃度為25ppm或更低，優選地10ppm或更低，更優選地5ppm或更低的ccl2，并且/或者所述組合物包含濃度至少低10倍，優選地低25倍，更優選地低100倍的ccl2。
8.根據權利要求1至7中任一項所述的方法，其中步驟(c)包括：
9.根據權利要求8所述的方法，其中在步驟(c1)后獲得的cd39或其變體存在于組合物中，所述組合物與使用未被工程化以減少cho細胞中ccl2產生的cho細胞的步驟(c1)后用相同方法獲得的組合物相比，包含濃度為100ppm或更低，優選地25ppm或更低，更優選地10ppm或更低的ccl2，并且/或者所述組合物包含濃度至少低10倍，優選地低25倍，更優選地低100倍的ccl2；并且/或者其中在步驟(c4)后獲得的cd39或其變體存在于組合物中，所述組合物與使用未被工程化以減少cho細胞中ccl2產生的cho細...
【專利技術屬性】
技術研發人員：D·奧斯蘭德，N·勒貝格，P·奧布德利克，J·A·R·塔帕雷爾，N·瓦格納，
申請(專利權)人：諾華股份有限公司，
類型：發明
國別省市：
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