血小板替代物和適于其制備的綴合方法技術

血小板替代物，包括纖維蛋白原或能用于治療的類似產品，其中含有結合上具有ＲＧＤ序列并且基本不降解的活性蛋白的載體。可通過綴合方法制備這種綴合物，綴合物中含有０．０１－２．５％重量的活性纖維蛋白原以及不超過５０％的非活性纖維蛋白原。（*該技術在2017年保護過期，可自由使用*）

【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及血小板替代物，即含有纖維蛋白原的組合物，并且還涉及特別是將纖維蛋白原結合列特定的載體上的綴合方法。
技術介紹
含有活性藥物和載體的共價結合的綴合物可用作將藥物運送到例如特定的作用位點的手段。已有人提出將白蛋白作為這種載體。WO-A-9618388公開了白蛋白微顆粒、其制備方法以及作為載體的用途。大分子和蛋白對人血清白蛋白微膠囊(HSA)的共價連結會產生許多問題。由于蛋白和微膠囊表面的接觸不好，因此不能獲得足夠的結合位點來進行交聯。而且，當使用短的或零長度的交聯劑例如乙醇醛或EDC時，分子內交聯要比分子間交聯難控制。這會使微膠囊的裝載量很低并且會使蛋白失活。Agam和Livne在一系列論文Blood 55186-191(1983)、Thromb.Haemostasis 51145-9(1984)和59504-6(1988)、和Eur.J.Clin.Invest.(1991)中提出，包被在固定的血小板上的纖維蛋白原會增加血小板的聚集，在患有血小板減少癥的大鼠中，包有纖維蛋白原的紅細胞使出血時間縮短。固定法包括使用甲醛的方法。Coller等人在J.Clin.Invest.89546-555(1992)中描述了“凝血紅細胞”，它是一種自體固有的、半人造的血小板輸血替代物。為了避免使用新鮮的血小板所帶來的局限性和缺陷，使用雙官能交聯劑將紅細胞結合在含有RGD細胞識別序列的肽上。在血栓形成和止血國際協會第XV次會議(1995年六月11-16日在Jerusalem，Israel舉行的)的摘要中，Yen等報告了有潛在止血能力的“凝血球”，即交聯的HSA微球，平均直徑為1.1-1.3μm，其中人纖維蛋白原共價結合在其表面上。在血小板減少癥兔子模型中，耳朵出血時間縮短了。據報道這種HSA微球是用US-A-5069936中的方法制備的，即用戊二醛作為交聯劑的溶解/去溶劑化過程，使用乙醇來沉淀，加入表面活性劑來修飾交聯蛋白分子的表面。這些步驟不能控制微球的大小，可能使結合蛋白降解，并且不適于大批量生產血小板替代物。US-A-5069936公開了不同生物分子的共價結合，但是沒有包括纖維蛋白原。其提出用聚醛作為共價交聯劑。實施例12和14分別用戊二醛來結合抗體和酶(堿性磷酸酶)。WO-A-9639128(在1996年12月12公開)也公開了“凝血球”。但是沒有提供具體的制備例。纖維蛋白原是含有RGD(S)序列的粘著性糖蛋白。它和其它糖蛋白(包括纖連蛋白和膠原)可介導癌細胞結合到內皮下層上。這些糖蛋白與在癌細胞中發現的整聯蛋白如纖連蛋白受體和血小板上的GPIIb/IIIa受體相互作用；參見Dardik et al，Int.J.Cancer 70201-7(1997)。對癌癥進行手術治療的一個主要問題是會增加癌細胞向循環系統擴散的危險性。這是患有前列腺癌的病人手術后發病率增加的原因之一。人們希望消除癌細胞在循環系統中的轉移，或抑制其在血管表面的沉積。專利技術簡述根據本專利技術的一個方面，一種將肽(表示任何肽、多肽、蛋白或其綴合物)如纖維蛋白原結合到微膠囊上的新方法允許蛋白和微膠囊之間插入間隔物(例如小肽或脂肪酸)。更具體的是，本專利技術利用了這一事實，即載體如HSA含有游離巰基，雙官能化合物能與其反應，其中雙官能化合物含有能與要結合的活性組分(藥物)選擇性反應的基團。根據本專利技術，可使交聯反應被控制，這是因為載體如HSA上的游離巰基的連接基團具有特異性。可控制的交聯反應是本專利技術的一個重要方面，因為其與結合分子的活性直接相關。根據應用的需要，間隔物可包括可被酶裂解的肽、易于被酸或堿裂解的鍵，并且具有不同的長度。間隔物的長度可以是本專利技術的另一重要方面，因為它可以決定與靶受體的結合能力，例如纖維蛋白原結合GPIIb/IIIa的結合能力。根據本專利技術的另一個方面，例如通過使用這種新方法，提供了一種可用作血小板替代物的新的可藥用產品。這種產品含有與纖維蛋白原結合的、基本上不使纖維蛋白原的活性喪失的不溶性載體，例如被穩定的白蛋白。結合可以是非化學結合，例如通過吸收作用的結合，或化學結合，例如使用長至少10nm的連接體來進行的結合。本專利技術第一次提供了純的、穩定的、治療可接受的血小板替代物。純化可在沒有化學交聯劑和/或表面活性劑的條件下實現。這些血小板替代物適于治療血小板減少癥。本專利技術的另一個特點是由于將纖維蛋白原用作靶試劑，本專利技術的產品可用于結合其它活性物質。這類物質的選擇與作用部位(通常是傷口處或其它出血部位)以及所明確的問題的性質有關。專利技術描述本專利技術使用的載體優選在能使粒徑和粒徑分布得到良好控制的條件下通過噴霧干燥來制備。例如，為了使顆粒能穿過毛細血管，優選的粒徑最大為6μm，例如1-4μm。WO-A-9218164、WO-A-9615814和WO-A-9618388完全公開了合適的材料和制備方法，以及通過加熱或化學交聯來穩定微顆粒的方法，這些專利在本專利技術中引作參考。正如在后面的公開物中所解釋的那樣，所描述的條件不影響官能團，例如白蛋白的巰基，因此官能團仍保持著與生物分子反應的能力。本專利技術使用的微顆粒可具有在上述兩篇出版物中描述的物理學特性，例如是光滑的和球形的，并且含有空氣。為了獲得不溶性、交聯的微膠囊，可將噴霧干燥產物與化學交聯劑反應。然而，加熱和γ-輻射是優選的，還可以將干粉產物進行滅菌處理。在本專利技術的一個實施方式中，可在沒有連接體的條件下將纖維蛋白原(或其它RGD肽)結合到載體上，例如通過吸收作用。這可通過將肽沉淀列微球的表面上來實現，例如通過控制pH值和其它條件，這對本領域普通技術人員來說是顯而易見的。然后將過量/未結合的纖維蛋白原洗掉。在本專利技術的另一個實施方式中，使用常規的雙官能試劑如聚醛來使纖維蛋白原結合到載體上。乙醇醛是優選的。間隔物的另一實例是4-(碘乙酰基)氨基苯甲酸磺基丁二酰亞胺酯(水不溶性)。其長度約為1nm。在本專利技術的第一個方面所述的結合步驟中，結合肽優選至少包括纖維蛋白原。其它實例有凝血因子VIII、凝血因子IX、其它血液因子、凝集級聯反應(coagulation cascade)蛋白、血栓溶解劑、抗體、α-1-抗胰蛋白酶。通過將例如纖維蛋白原和凝血因子VIII聯合使用，本專利技術的產品能有效地治療血友病。此外，或作為替代物代替溶解血栓的藥物如尿激酶，用超聲來處理血凝塊。對于這種處理，本專利技術中含有空氣的微膠囊是特別合適的。本專利技術中使用的雙官能化合物(如Y1-Y-Y2)可通過將較簡單的化合物Y1-Y3-Y4與Y5-Y6-Y2反應來得到，其中Y1是巰基-特異性反應基團，Y4和Y5一起反應使得Y3和Y6一起形成間隔基團Y，Y2是藥物反應基團。因此，例如在ICH2COOH中，Y1是巰基反應團I和/或Y4是COOH。更具體地，加入EDC(可加入N-羥基丁二酰亞胺來促進EDC催化的酰胺化反應，反應生成活潑的丁二酰亞胺酯)可使碘乙酸活化。然后將被活化的物質與肽或含有游離氨基(Y5)和末端羧基(Y2)的分子一起溫育。合適的肽含有如3-6個氨基酸如甘氨酸或丙氨酸。然后用EDC活化中間體綴合物上的羧基。將活化的間隔物與蛋白一起培養，則間隔物上的羧基與蛋白側鏈上的賴氨酸的氨基形成了一個肽鍵。間隔物上只有一端能結合到蛋白上，因此，此時沒本文檔來自技高網...

【技術保護點】
含有不溶性載體的可藥用產品，其中不溶性載體結合有含有ＲＧＤ序列并且基本未降解的活性蛋白。

【技術特征摘要】
GB 1996-10-21 9621886.2;GB 1997-2-10 9702652.01.含有不溶性載體的可藥用產品，其中不溶性載體結合有含有RGD序列并且基本未降解的活性蛋白。2.根據權利要求1的產品，其中結合是非化學結合，例如通過吸收作用的結合。3.根據權利要求1的產品，其中結合是在沒有表面活性劑的情況下，通過化學連接體進行的共價結合。4.根據權利要求1的產品，其中結合是通過長至少10nm的化學連接體進行的共價結合。5.根據前述任一項權利要求的產品，其中載體包括交聯的蛋白微粒。6.根據權利要求15的產品，其中微顆粒蛋白是白蛋白。7.根據前述任一項權利要求的產品，其中RGD蛋白是纖維蛋白原。8.根據權利要求7的產品，其中含有0.01-2.5％重量的活性纖維蛋白原，和不超過50％的非活性纖維蛋白原。9.制備式X-S-Y-Z共價結合物的方法，其中X-SH是有游離巰基的載體，Y是間隔物，Z是活性組分，反應包括以下步驟將活性組分與式Y1-Y-Y2雙官能劑反應，其中Y1是能與疏基選擇性反應的基團，Y2是能與活性組分但不能與巰基反應的基團和將得到的Y1-Y-Z與載體反應。10.根據權利要求9的方法，其中Y1是I。11.根據權利要求9或1...

【專利技術屬性】
技術研發人員：D赫斯，SM米德勒頓，R哈里斯，NJ丘奇，
申請(專利權)人：廓德倫特健康護理英國有限公司，
類型：發明
國別省市：GB[英國]