本發(fā)明專利技術(shù)披露了一種棘孢木霉菌的篩選方法及其應(yīng)用，其中方法包括：采集砷污染土壤樣品，在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)從該土壤樣品中分離出真菌，將該真菌在不同砷濃度下培養(yǎng)，并觀察菌落的生長狀況及其對砷的耐性，由此篩選出棘孢木霉菌。利用本發(fā)明專利技術(shù)篩選出的棘孢木霉菌，可以制成相應(yīng)的微生物制劑，將制得的微生物制劑應(yīng)用在污染土壤或環(huán)境中后，通過該棘孢木霉菌的富集和揮發(fā)作用，能夠在一定程度上降低土壤中砷的含量，特別是降低土壤有效砷的含量，從而保證作物正常生長，并使作物和農(nóng)產(chǎn)品中砷的含量達(dá)到無公害農(nóng)產(chǎn)品要求。
【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及真菌的篩選方法及其應(yīng)用，尤其涉及棘孢木霉菌(Trichoderma asperellum)的篩選方法及其應(yīng)用。
技術(shù)介紹
砷是一種在自然界廣泛存在的有毒并且致癌的非金屬元素，砷污染已成為全球危害十分嚴(yán)重的環(huán)境問題之一。據(jù)報(bào)道，全球至少5000多萬人口正面臨著地方性砷中毒的威脅，其中大多數(shù)為亞洲國家，中國是受砷中毒危害最為嚴(yán)重的國家之一，在1956-1984年二十多年間，中國曾發(fā)生過30余起地砷中毒事件。我國是砷礦大國，砷礦廣泛分布在我國的中南和西南的湖南、云南、廣西、廣東等省區(qū)，砷礦開采或冶煉，含砷農(nóng)藥、化肥等農(nóng)資產(chǎn)品的過量投入等，可造土壤砷的累積，進(jìn)而影響著植物、動(dòng)物的生長和發(fā)育，且可以通過食物鏈進(jìn)入人體，對人類的生存和健康構(gòu)成威脅。目前常用的砷污染土壤修復(fù)方法包括土壤改良劑法、客土法、化學(xué)沖洗法以及生物修復(fù)方法等。生物修復(fù)方法是利用生物(主要是植物、微生物)的作用來消減、凈化土壤中的砷或改變砷的結(jié)合形態(tài)和價(jià)態(tài)，被普遍認(rèn)為是砷污染環(huán)境治理中最具應(yīng)用前景的技術(shù)。其中， 利用超富集植物去除土壤中砷的植物修復(fù)技術(shù)在最近幾年中取得了突破性的進(jìn)展，蜈蚣草 (Brakefern,Pteris vitta)和大葉井口邊草(Pteris nervosa)等砷超富集植物相繼被發(fā)現(xiàn)，并可用于砷污染地區(qū)的土壤修復(fù)。在重金屬污染土壤的生物修復(fù)技術(shù)中，除應(yīng)用超富集植物吸收和富集重金屬外，利用植物、微生物將土壤中的重金屬轉(zhuǎn)化為難溶態(tài)或氣態(tài)化合物形式揮發(fā)到大氣中，從而達(dá)到鈍化甚至去除土壤中重金屬的目的，也逐漸引起了人們的重視。如Terry等利用微生物和植物的作用，將環(huán)境中的硒(Se)轉(zhuǎn)化為生物毒性較低的氣態(tài)形式(二甲基硒和二甲基二硒)，將其直接或通過植物的組織揮發(fā)到大氣中。Meagher等將細(xì)菌體內(nèi)的汞(Hg)還原酶基因轉(zhuǎn)入芥子科植物Arabidopsis后，得到的轉(zhuǎn)基因植物能耐受、吸收土壤環(huán)境中的Hg，并將Hg2+還原成Hg°使其揮發(fā)進(jìn)入大氣。土壤中的砷化合物也可以轉(zhuǎn)變?yōu)闅鈶B(tài)的甲基砷等物質(zhì)，在多個(gè)圈層中遷移和轉(zhuǎn)化。因此，利用某些微生物的對砷的富集、利用和轉(zhuǎn)化等功能，將As累積到生物體內(nèi)或使其轉(zhuǎn)化為易揮發(fā)態(tài)的砷化合物，已成為潛在的As污染土壤修復(fù)技術(shù)之一。目前，國內(nèi)還沒有對砷具有生物累積與揮發(fā)能力真菌的報(bào)道，國外的相關(guān)報(bào)道也屈指可數(shù)，且大多數(shù)還局限于實(shí)驗(yàn)室研究階段。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)所要解決的技術(shù)問題是提供一種棘孢木霉菌的篩選方法，將棘孢木霉菌應(yīng)用于治理砷污染土壤以及減少砷在作物和農(nóng)產(chǎn)品中的累積。為了解決上述技術(shù)問題，本專利技術(shù)提供了一種棘孢木霉菌的篩選方法，包括采集砷污染土壤樣品，在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)從該土壤樣品中分離出真菌，將該真菌在不同砷濃度下培養(yǎng)，并觀察菌落的生長狀況及其對砷的耐性，由此篩選出棘孢木霉菌。優(yōu)選地，該方法具體包括將所述土壤樣品經(jīng)梯度稀釋后涂布于砷含量為400 600mg/L的馬丁培養(yǎng)基上分離出所述真菌；將分離出的真菌經(jīng)多次純化、培養(yǎng)后，取直徑為8 IOmm的圓形真菌菌塊或邊長為8 IOmm的方形真菌菌塊，置于含砷1000mg/kg的PGP培養(yǎng)基上，比較菌落的生長狀況， 從中篩選出具有較高抗砷能力的棘孢木霉菌菌株。優(yōu)選地，馬丁培養(yǎng)基的成分包括葡萄糖、蛋白胨、KH2P04、MgSO4 · 7H20、瓊脂以及水，各成分的重量比為20 10 2 1 80 4000 ；PGP培養(yǎng)基的成分包括馬鈴薯、葡萄糖、蛋白胨以及水，各成分的重量比為 40 4 1 400。為了解決上述技術(shù)問題，本專利技術(shù)提供了一種棘孢木霉菌對砷的抗性的鑒定方法， 包括在室內(nèi)培養(yǎng)條件下測定棘孢木霉菌對砷的生物累積與揮發(fā)能力，以及在含有不同濃度砷溶液的培養(yǎng)條件下棘孢木霉菌生物量的變化，由此鑒定棘孢木霉菌對砷的抗性。優(yōu)選地，在室內(nèi)培養(yǎng)條件下測定棘孢木霉菌對砷的生物累積與揮發(fā)能力，具體包括配制總砷含量為50mg/L的PGP培養(yǎng)基，在120 125°C下滅菌14 17分鐘后，接入0. Iml棘孢木霉菌生物量為104cfu/ml的菌懸液，培養(yǎng)溫度為M 27°C，轉(zhuǎn)速為138 142rmp,培養(yǎng)5天后，以3800 4200rmp進(jìn)行離心處理8 12分鐘，用超純水反復(fù)清洗菌質(zhì) 4次，洗掉殘留的培養(yǎng)基，將該菌質(zhì)于48 52°C下烘干至恒重，然后對該菌質(zhì)稱重，用11 13ml體積比為4 6 1的HN03、HClO4混合液在158 162°C條件下將所述菌質(zhì)消煮10 小時(shí)，采用原子熒光測定該菌質(zhì)中的總砷含量；將離心出的培養(yǎng)液及清洗該菌質(zhì)的超純水混合后作為上清液采用原子熒光測定總砷含量；菌質(zhì)中的總砷含量作為棘孢木霉菌對砷的生物累積量，棘孢木霉菌對砷的揮發(fā)量 =配置的總砷含量-菌質(zhì)中的總砷含量-上清液中的總砷含量。優(yōu)選地，參照在總砷含量為50mg/L的PGP培養(yǎng)基中接入棘孢木霉菌的處理，分別以在總砷含量為50mg/L的PGP培養(yǎng)基中不接入棘孢木霉菌處理以及在PGP培養(yǎng)基中接入棘孢木霉菌而不添加砷的處理作為對照，對每項(xiàng)處理均重復(fù)多次。優(yōu)選地，在室內(nèi)條件下測定在含有不同濃度砷溶液的培養(yǎng)條件下棘孢木霉菌生物量的變化，具體包括配制總砷含量范圍為0 200mg/L的PGP培養(yǎng)基，在120 122°C溫度下滅菌14 16分鐘后，將生長速率相同的8 IOmm棘孢木霉菌菌塊分別加入以上處理中，于搖床上溫度為23 27°C，轉(zhuǎn)速為138 142rmp振蕩培養(yǎng)；培養(yǎng)5天后，培養(yǎng)液以3800 4200rmp離心8 12分鐘，并采用稀釋梯度法對懸液中的孢子數(shù)目進(jìn)行計(jì)數(shù)；用超純水反復(fù)清洗菌質(zhì)4次，洗掉殘留的培養(yǎng)基后，將菌質(zhì)于48 52°C下烘干至恒重，然后稱量菌質(zhì)重量，即棘孢木霉菌生物量。優(yōu)選地，將不同砷含量下的相應(yīng)處理均重復(fù)多次。5優(yōu)選地，該方法還包括觀察隨著培養(yǎng)液中總砷含量的增加棘孢木霉菌生物量的變化趨勢，并觀察棘孢木霉菌生物量達(dá)到最高時(shí)培養(yǎng)液的砷含量，由此確定棘孢木霉菌表現(xiàn)出的對砷抗性的含量范圍。為了解決上述技術(shù)問題，本專利技術(shù)提供了一種棘孢木霉菌在砷污染土壤治理以及降低砷在作物及農(nóng)產(chǎn)品中累積方面的應(yīng)用。利用本專利技術(shù)篩選出的棘孢木霉菌，可以制成相應(yīng)的微生物制劑，將制得的微生物制劑應(yīng)用在污染土壤或環(huán)境中后，通過該棘孢木霉菌的富集和揮發(fā)作用，能夠在一定程度上降低土壤中砷的含量，特別是降低土壤有效砷的含量，從而保證作物正常生長，并使作物和農(nóng)產(chǎn)品中砷的含量達(dá)到無公害農(nóng)產(chǎn)品要求。附圖說明圖1為棘孢木霉菌在不同砷濃度水平下的生長曲線圖。 具體實(shí)施例方式本專利技術(shù)提供的棘孢木霉菌的篩選和培養(yǎng)方法，包括從砷污染的土壤中分離出真菌，觀察分離出的真菌在不同濃度砷脅迫下的菌落生長狀況，由此篩選出棘孢木霉菌；在室內(nèi)培養(yǎng)條件下觀察分離出的棘孢木霉菌對砷的揮發(fā)能力。對篩選出的棘孢木霉菌接種于含有不同濃度砷的液態(tài)PGP培養(yǎng)基中，觀察棘孢木霉菌生物量的變化，結(jié)果表明該木霉菌在0-50mg/L的砷濃度范圍內(nèi)表現(xiàn)出較強(qiáng)的對砷的抗性，且當(dāng)含砷濃度為50mg/L時(shí)顯著性地刺激了該木霉菌株的生長；隨后進(jìn)行的棘孢木霉菌對砷的生物累積量與揮發(fā)量測定實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)對該棘孢木霉菌培養(yǎng)時(shí)間為5天，且在培養(yǎng)基中加入的砷濃度為50mg/L時(shí)，該棘孢木霉菌對砷的生物累積量為11. 21 μ g，生物揮發(fā)量為111. 99 μ g本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
１．一種棘孢木霉菌的篩選方法，包括：采集砷污染土壤樣品，在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)從所述土壤樣品中分離出真菌，將所述真菌在不同砷濃度下培養(yǎng)，并觀察菌落的生長狀況及其對砷的耐性，由此篩選出所述棘孢木霉菌。
【技術(shù)特征摘要】
1.一種棘孢木霉菌的篩選方法，包括采集砷污染土壤樣品，在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)從所述土壤樣品中分離出真菌，將所述真菌在不同砷濃度下培養(yǎng)，并觀察菌落的生長狀況及其對砷的耐性，由此篩選出所述棘孢木霉菌。2.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，具體包括將所述土壤樣品經(jīng)梯度稀釋后涂布于砷含量為400 600mg/L的馬丁培養(yǎng)基上分離出所述真菌；將分離出的真菌經(jīng)多次純化、培養(yǎng)后，取直徑為8 IOmm的圓形真菌菌塊或邊長為 8 IOmm的方形真菌菌塊，置于含砷1000mg/kg的PGP培養(yǎng)基上，比較所述菌落的生長狀況，從中篩選出具有較高抗砷能力的所述棘孢木霉菌菌株。3.按照權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述馬丁培養(yǎng)基的成分包括葡萄糖、蛋白胨、KH2P04、MgS04*7H20、瓊脂以及水，各成分的重量比為20 10 2 1 80 4000 ；所述PGP培養(yǎng)基的成分包括馬鈴薯、葡萄糖、蛋白胨以及水，各成分的重量比為 40 4 1 400。4.一種棘孢木霉菌對砷的抗性的鑒定方法，包括在室內(nèi)培養(yǎng)條件下測定棘孢木霉菌對砷的生物累積與揮發(fā)能力，以及在含有不同濃度砷溶液的培養(yǎng)條件下棘孢木霉菌生物量的變化，由此鑒定所述棘孢木霉菌對砷的抗性。5.按照權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述在室內(nèi)培養(yǎng)條件下測定棘孢木霉菌對砷的生物累積與揮發(fā)能力，具體包括配制總砷含量為50mg/L的PGP培養(yǎng)基，在120 125 °C下滅菌14 17分鐘后，接入0. Iml棘孢木霉菌生物量為104cfu/ml的菌懸液，培養(yǎng)溫度為M 27°C，轉(zhuǎn)速為138 142rmp,培養(yǎng)5天后，以3800 4200rmp進(jìn)行離心處理8 12分鐘，用超純水反復(fù)清洗菌質(zhì)4次，洗掉殘留的培養(yǎng)基，將菌質(zhì)于48 52°C下烘干至恒重，然后對菌質(zhì)稱重，用11 13ml體積比為4 6 1的H...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：曾希柏，蘇世鳴，蔣細(xì)良，白玲玉，李蓮芳，
申請(專利權(quán))人：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境與可持續(xù)發(fā)展研究所，
類型：發(fā)明
國別省市：11
還沒有人留言評(píng)論。發(fā)表了對其他瀏覽者有用的留言會(huì)獲得科技券。