一株棘孢木霉菌株及其應用制造技術

本發明專利技術公開了一株棘孢木霉菌株及其應用，該棘孢木霉菌株命名為棘孢木霉(Trichoderma?asperellum)Thz01，保藏號為CGMCC?No.6422。本發明專利技術的棘孢木霉菌株是從辣椒生境中分離出來的，對辣椒疫霉菌具有顯著的拮抗作用，明顯重寄生于辣椒疫霉菌，能有效降解辣椒疫霉菌的菌絲體；用該菌株制備得到的生防制劑，可有效防治辣椒疫病。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及植物病害的生物防治領域，尤其涉及一株棘孢木霉菌株及其應用。
技術介紹
辣椒疫病俗稱“死秧病”,是由辣椒疫霉(Phytophthora capsici)引起的一種土傳病害。該病原菌的細胞壁的主要成份是纖維素，而不同于常見的真菌病原菌(如子囊菌和擔子菌)細胞壁的主要成份是幾丁質。辣椒疫病是我國辣椒上的一種毀滅性病害，可造成嚴重產量損失。由于該病害是一種土傳病害，病原菌可長期存活在土壤中，該病害也是生產上最難防治的一種病害。尤其該病原菌生物學特征的獨特性，病害防治的方法和技術也明顯不同與其它病害的防治。該病害目前主要采用化學農藥防治，這些常規防控技術已難以有效控制，且易引起生態、環境問題。而生防制劑在該病害的應用更是罕見。雖然木霉菌是目前為止研究最多的生防真菌，其分布很廣，生存于多種生態環境中。據不完全資料統計，木霉至少對18個屬29種病原真菌在體外或體內表現有拮抗作用。木霉容易分離和培養，可在多種基質上生長，具有對一定逆境條件的忍耐能力，這些特點決定了木霉菌在植病生防中的重要地位。其作用機制一般認為有4種，競爭作用，重寄生作用，酶的溶菌作用和抗菌素類的產生。從致病的植株生境中分離生防菌是一種常用的得到生防微生物的做法。然而，研究木霉菌防治辣椒疫病的機制幾乎未見。公開號CN101485336B的專利技術專利公開了一種防治作物土傳病害的木霉菌制劑及其制備方法。該制劑的組成是，在載體中含有有效量的哈茨木霉(Trichoderma Harzianum)菌株TH-192CGMCC NO. 2634。制備方法包括菌株TH-192的擴大培養、液體和固體發酵培養及添加促進劑等步驟。該制劑對根腐病、白絹病、立枯病、菌核病等作物土傳病害具有一定的防治作用，但其未公開對辣椒疫病的防治情況。公開號CN102428966A的專利技術專利申請公開了一種作物病害防治復合生物制劑。其原料組成為擬康氏木霉發酵液、枯草芽孢桿菌發酵液、水溶性甲殼糖、味精殘液、黃腐酸鉀。其中，擬康氏木霉和枯草芽孢桿菌是經過篩選和誘變處理獲得的高效菌株，并通過液體深層發酵技術獲得擬康氏木霉和枯草芽孢桿菌發酵液，再組合制成作物病害防治復合生物制劑，特別地，對枯萎病和黃萎病具有較明顯的防治效果。但該復合生物制劑需要多種菌株和原料，且配制過程較繁瑣，不利于大規模推廣應用。這些木霉菌防治的病原菌都是由子囊菌和擔子菌引起的，與生防辣椒疫病的機制完全不同。我們篩選的生防菌是針對具有纖維素細胞壁的辣椒疫霉菌，不同于這些研究報道。
技術實現思路
本專利技術提供了一株棘孢木霉菌株，具有較強的重寄生作用，能有效降解辣椒疫霉菌的菌絲體，具有較好的辣椒疫病生防潛力。3一株棘孢木霉菌株,命名為棘孢木霉(Trichoderma asperellum)Thz01,保藏號為CGMCC No. 6422。所述的棘孢木霉菌株已保藏，保藏單位位于北京市朝陽區北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日期2012年8月13號，保藏號=CGMCC No. 6422。依據形態學特征和分子數據分析，該菌株的分類命名為棘孢木霉(Trichoderma asperellum)。所述的棘孢木霉ThzOl菌株是從臨安高山蔬菜園發病的辣椒根圍土土壤中采集得到的，該菌株的生物學特性為菌落在PDA固體培養基上25°C下培養，3-4天擴展為9cm,初期白色稀疏，菌絲沿培養基表面匍匐生長，后形成綠色產孢區，反面白色，菌絲具隔；分生孢子球形，近球形，單個近無色，聚集時呈淡黃綠色，壁光滑。瓶梗直、安瓶形，寬度3.0-5. 6 μ m。CMD上分生孢子球形至亞球形，3. 8-5. 9X2. 8-4. 8 μ m。形態學特征符合棘孢木霉菌特征。依據ITS rDNA (SEQ ID NO. I)和轉錄因子la(tef I-a)序列分析,與GenBank中的模式和證實的棘孢木霉菌序列最一致。這些證實該菌株為棘孢木霉(Trichodermaasperellum)。本專利技術提供了上述棘孢木霉菌株在抑制辣椒疫霉生長中的應用。該菌株在與辣椒疫霉對峙培養時，生長迅速，能有效覆蓋辣椒疫霉的菌落，明顯重寄生于辣椒疫霉菌，并將其菌絲體完全降解，已顯示是一個具有較好生防潛力的微生物資源。本專利技術還提供了一種防治辣椒疫病的生防制劑的制備方法，包括將棘孢木霉ThzOl種子液接種到煮熟滅菌的麥粒中，培養12-20天，培養期間及時翻動，制得生防制劑。所述的棘孢木霉ThzOl種子液可以通過如下方法制備將棘孢木霉ThzOl接種到PDA培養基中，于23-28°C下培養5_6天；培養完成后，將孢子刮入滅菌水中，配制得到棘孢木霉ThzOl種子液。所述的棘孢木霉ThzOl種子液的活菌濃度優選為IO7-IO8個/mL。所述的麥粒是適合棘孢木霉ThzOl生長的基質。棘孢木霉ThzOl種子液接入麥粒后的培養時間優選為15天，便于菌種充分生長。培養期間及時翻動可以使麥粒上充分長上棘孢木霉ThzOl孢子。以每千克麥粒計，所述的棘孢木霉ThzOl種子液的用量優選為2_4mL。本專利技術還提供了一種采用上述制備方法制得的生防制劑，該生防制劑為顆粒狀，含有棘孢木霉ThzOl。本專利技術還提供了一種防治辣椒疫病的方法，包括將上述生防制劑與辣椒種子混合，然后進行接種、栽培；或者，在辣椒苗移植后，將上述生防制劑施加于辣椒苗根部，然后進行栽培。為了獲得更好的生防效果，所述的生防制劑的用量優選為I. 0-1. 5g/株辣椒，約為20-30粒/株辣椒。本專利技術提供的棘孢木霉ThzOl是從辣椒生境中分離出來的，對辣椒疫霉菌具有顯著的拮抗作用，明顯重寄生于辣椒疫霉菌，在培養基上能完全降解辣椒疫霉菌的菌絲體；用該菌株制備得到的生防制劑，可有效防治辣椒疫病。附圖說明圖I為棘孢木霉ThzOl與辣椒疫霉對峙培養實驗結果，其中，I號為對照；2、3、4號皿左邊的菌碟為辣椒疫霉，右邊的菌碟為棘孢木霉ThzOI。圖2為本專利技術實施例3中制得的生防制劑。具體實施方式實施例I菌株的分離、純化、鑒定和保藏I、木霉菌的分離、純化將從發病的辣椒根圍土采集的土壤充分混勻后，去少量土粒放于含有氯霉素的PDA平板上，每個平板4個土粒，重復三次。置于25°C下黑暗培養。等到木霉產孢后，及時挑出到新的PDA平板上。短期保存的菌種于PDA斜面試管中，保存于4°C冰箱中。長期保存的木霉菌在_20°C的冰箱中(孢子+17%脫脂奶粉+硅膠顆粒)。2、木霉囷的種類鑒定該菌株的生物學特性為菌落在PDA固體培養基上25°C下培養，3-4天擴展為9cm，初期白色稀疏，菌絲沿培養基表面匍匐生長，后形成綠色產孢區，反面白色，菌絲具隔；分生孢子球形，近球形，單個近無色，聚集時呈淡黃綠色，壁光滑。瓶梗直、安瓶形，寬度3.0-5. 6μπι。CMD上分生孢子球形至亞球形，3. 8-5. 9X2. 8-4. 8 μ m。形態學特征符合棘孢木霉菌特征。對該菌株進行分子生物學鑒定(I)真菌基因組的提取采用CTAB法提取真菌基因組。(2)基因片段的擴增1TS rDNA、tef I-a的PCR擴增ITS1-5. 8S-ITS2片段采用真菌核糖體基因轉錄間隔區通用引物ITS6(5’ -GAAGGTGAAGTCGTAACAAGG-3，)和本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一株棘孢木霉菌株，其特征在于，命名為棘孢木霉(Trichoderma？asperellum)Thz01，保藏號為CGMCC？No.6422。

【技術特征摘要】
1.一株棘孢木霉菌株，其特征在于，命名為棘孢木霉(Trichoderma asperellum)ThzOl，保藏號為 CGMCC No. 6422。2.如權利要求I所述的棘孢木霉菌株在抑制辣椒疫霉生長中的應用。3.一種防治辣椒疫病的生防制劑的制備方法，其特征在于，包括將棘孢木霉ThzOl種子液接種到煮熟滅菌的麥粒中，培養12-20天，培養期間及時翻動，制得生防制劑。4.根據權利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述的棘孢木霉ThzOl種子液的活菌濃度為IO7-I...

【專利技術屬性】
技術研發人員：張敬澤，蔣恒，蕭芳，
申請(專利權)人：浙江大學，
類型：發明
國別省市：