生產重組混合異淀粉酶、α淀粉酶和葡萄糖淀粉酶制造技術

本發明專利技術公開了生產重組混合異淀粉酶、α淀粉酶和葡葡萄糖淀粉酶方法。屬生物技術領域。首先從解淀粉假單胞桿菌基因組中擴增異淀粉酶基因，從地衣芽孢桿菌基因組中擴增α淀粉酶基因，從大麥基因組中擴增α淀粉酶基因，從黑曲霉菌基因組中擴增葡萄糖淀粉酶基因；分別構建含異淀粉酶、兩種α淀粉酶和葡萄糖淀粉酶基因的枯草芽孢桿菌表達載體、畢赤酵母表達載體和釀酒酵母表達載體；構建工程菌：將枯草芽孢桿菌表達載體轉化枯草芽孢桿菌基因組，將畢赤酵母表達載體轉化畢赤酵母基因組，將釀酒酵母表達載體轉化釀酒酵母基因組；發酵工程菌生產重組混合異淀粉酶、α淀粉酶和葡萄糖淀粉酶。這些酶的混合應用能顯著地加強水解淀粉為葡萄糖的作用。生產混合酶的優越性在于，將常規需要幾道工序分別生產異淀粉酶、α淀粉酶和葡萄糖淀粉酶，轉變為一道工序生產這三種酶的混合酶，起到顯著地減少能耗和降低生產成本的作用。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于生物
，涉及構建微生物工程菌生產重組蛋白。具體是應用微生物工程菌生產重組混合異淀粉酶、α淀粉酶和葡萄糖淀粉酶。
技術介紹
淀粉必須水解為葡萄糖才能被轉化為乙醇，人體不能直接吸收淀粉，但是能直接吸收葡萄糖。每年世界上需要生產大量的異淀粉酶、α-淀粉酶和葡萄糖淀粉酶而應用于將淀粉轉化于葡萄糖的飴糖、釀酒和美食等行業。淀粉由直鏈和支鏈組成。支鏈由α-1，6糖苷鍵連接，而直鏈的糖分子之間由 α-1,4糖苷鍵連接。在天然的淀粉質原料中，支鏈淀粉的含量約占70 % 95 %，而直鏈淀粉的含量< 30%。異淀粉酶(Isoamylase，Ε. C. 3. 2. 1. 68)能專一性地分解支鏈淀粉中分支點的α-1，6糖苷鍵，將支鏈淀粉轉化為直鏈淀粉，因此又稱為脫支酶。α-淀粉酶 (a-amylase,EC. 3. 2. 1. 1)是一種能從直鏈淀粉分子內部切開α _1，4糖苷鍵的內切酶，產物包括麥芽糖、麥芽三糖和其它寡聚糖。葡萄糖淀粉酶(Glucoamylase，Ε. C. 3. 2. 1. 3)，簡稱糖化酶。葡萄糖淀粉酶能催化淀粉水解為葡萄糖，其葡萄糖主要是來源于直鏈淀粉。因為它主要是水解直鏈淀粉的α-1.4糖苷鍵，歲能水解α-1，6糖苷鍵，但其水解α_1，6糖苷鍵比速率僅為作用于α-1，4糖苷鍵的0.2%。若在淀粉中只加異淀粉酶那么只能剪切淀粉的支鏈，其產物是直連淀粉而不是葡萄糖；若在淀粉中加入α淀粉酶，其產物是麥芽糖、麥芽三糖和α糊精而不是葡萄糖；若在淀粉中加入葡萄糖淀粉酶，獲得的葡萄糖產物主要是來自于直鏈淀粉。根據異淀粉酶、α 淀粉酶和葡萄糖淀粉酶的作用機理，若異淀粉酶、α淀粉酶和葡萄糖淀粉酶聯合應用，那么將能充分地、高效地將淀粉轉化為葡萄糖。當前市面上只有這些酶的單種酶，尚沒有混合表達這些酶的菌種和混合酶產品。 枯草芽孢桿菌，畢赤酵母和釀酒酵母都是常用于生產重組蛋白的宿主菌，但各具有特征。畢赤酵母的主要特征是分泌極少自身蛋白有利于表達產物的純化的特點，枯草芽孢桿菌和釀酒酵母具有兼性需氧的特性，適合于固態厭氧發酵的大規模地低能耗的酶的生產。
技術實現思路
本專利技術根據異淀粉酶、α淀粉酶和葡萄糖淀粉酶具有聯合水解淀粉的作用，市場上還沒有異淀粉酶、α淀粉酶和葡萄糖淀粉酶的混合酶產品，枯草芽孢桿菌，畢赤酵母和釀酒酵母是常用于表達外源蛋白的宿主菌，而通過分子生物學技術將來自解淀粉假單胞桿菌的異淀粉酶、地衣芽孢桿菌的α淀粉酶、大麥的α淀粉酶和黑曲霉菌的葡萄糖淀粉酶基因重組于枯草芽孢桿菌基因組、畢赤酵母基因組和釀酒酵母基因組。用含異淀粉酶、兩種α 淀粉酶和葡萄糖淀粉酶基因的枯草芽孢桿菌工程菌，畢赤酵母工程菌和釀酒酵母工程菌生產重組混合異淀粉酶、α淀粉酶和葡萄糖淀粉酶。本專利技術所采用的技術方案是1.克隆酶基因應用PCR技術，從解淀粉假單胞桿菌基因組中擴增異淀粉酶基因， 從地衣芽孢桿菌基因組中擴增α淀粉酶基因，從大麥基因組中擴增α淀粉酶基因，從黑曲霉菌基因組中擴增葡萄糖淀粉酶基因；2.克隆構建表達載體的相關原件(啟動子，重組序列，信號肽，轉錄終止序列和抗性基因)3.構建如附圖1，附圖2和附圖3的三種表達載體。4.通過表達載體將異淀粉酶、兩種α淀粉酶和葡萄糖淀粉酶基因轉化枯草芽孢桿菌，畢赤酵母和釀酒酵母基因組。即構建含異淀粉酶、兩種α淀粉酶和葡萄糖淀粉酶基因的枯草芽孢桿菌工程菌，畢赤酵母工程菌和釀酒酵母工程菌。5.發酵含異淀粉酶、兩種α淀粉酶和葡萄糖淀粉酶基因的枯草芽孢桿菌工程菌、 畢赤酵母工程菌和釀酒酵母工程菌生產重組混合異淀粉酶、α淀粉酶和葡萄糖淀粉酶。本專利技術構建含異淀粉酶、α淀粉酶和葡萄糖淀粉酶基因的工程菌生產重組混合異淀粉酶、α淀粉酶和葡萄糖淀粉酶優點體現于(1)針對異淀粉酶、α淀粉酶和葡萄糖淀粉酶具有協同水解淀粉生成葡萄糖的特性，異淀粉酶、α淀粉酶和葡萄糖淀粉酶混合酶的添加能達到顯著地加強水解淀粉為葡萄糖的作用，而市場上需求這種混合酶產品。本專利技術通過構建工程菌，應用工程菌生產重組混合異淀粉酶、α淀粉酶和葡萄糖淀粉酶，一方面提供混合酶的新產品，另一方面取代分別發酵含異淀粉酶基因的菌株生產異淀粉酶，發酵含α淀粉酶基因菌株生產α淀粉酶，發酵含葡萄糖淀粉酶基因的菌株生產葡萄糖淀粉酶。即用一個發酵工序生產整個水解淀粉生成葡萄糖酶系的酶取代用多個工序分別生產異淀粉酶，α淀粉酶和葡萄糖淀粉酶。達到節省了原材料、能耗和人力資源的作用。(2)枯草芽孢桿菌，畢赤酵母和釀酒酵母在生產重組蛋白方面各具特征，本專利技術分別構建含異淀粉酶、兩種α淀粉酶和葡萄糖淀粉酶基因的枯草芽孢桿菌工程菌，畢赤酵母工程菌和釀酒酵母工程菌，為其重組酶生產提供多種宿主選擇。附圖說明附圖1.含異淀粉酶、兩種菌表達載體附圖2含異淀粉酶、兩種c 載體附圖3含異淀粉酶、兩種c 載體具體實施例方式下面用非限定性實施例對本專利技術作進一步說明。實施例1 構建枯草芽孢桿菌工程菌，生產重組混合異淀粉酶、α淀粉酶和葡萄糖淀粉酶1. 1構建枯草芽孢桿菌表達載體1. 1. 1構建克隆載體α淀粉酶和葡萄糖淀粉酶基因表達框架的枯草芽孢桿淀粉酶和葡萄糖淀粉酶基因表達框架的畢赤酵母表達淀粉酶和葡萄糖淀粉酶基因表達框架的釀酒酵母表達4DNA合成含氨芐青霉素(AMP)基因序列，多克隆接頭和大腸桿菌復制起點，在其序列的兩端形成堿基互補。通過DNA連接酶的作用使其環化，形成DNA克隆載體。將其克隆載體命名為ρΒΡΑ。1. 1.2獲取基因①PCR擴增異淀粉酶基因提取解淀粉假單胞桿菌基因組DNA，應用引物(5，CGGATATC GCCATCAACAGCATGAGC3 ‘ ； 5 ‘ CGGATATCGGCTACTTGGAGATCAACAG3，)進行 PCR 擴增，PCR 產物經序列測定和用NCBI提供的BLAST軟件分析證明是異淀粉酶基因序列。②PCR擴增地衣芽孢桿菌的α淀粉酶基因(包括信號肽)提取地衣芽孢桿菌的基因組DNA，應用引物(5 ’ Atgaaacaacaaaaacggct3，； 5’ ctatctttgaacataaattg3’ )進行PCR擴增，PCR產物經序列測定和用NCBI提供的BLAST 軟件分析證明是含信號肽的α淀粉酶基因序列。③PCR擴增大麥的α淀粉酶基因(包括信號肽)應用RNA提取試劑盒提取黑曲霉菌的RNA，應用cDNA合成試劑盒合成其cDNA，應用引物(5，ATGGGGAAGAACGGCAGCCT 3，，5，TCAGCTCCGTTGTAGTGTTGCCGCGGCACC3，)進行 PCR 擴增，獲得的PCR產物經序列分析和用NCBI提供的BLAST軟件分析證明是含信號肽的α 淀粉酶基因序列。④PCR擴增葡萄糖淀粉酶基因(包括信號肽)應用RNA提取試劑盒提取黑曲霉菌的RNA，應用cDNA合成試劑盒合成其cDNA，應用弓 I 物(5，atgtcgttccgatctcttct3，5，CTAccgccaggtgtcagtcaccgtcgcggt3，)進行 PCR 擴增，獲得的PCR產物經序列分析和用NCBI提供的BLAST軟件分析證明是含信號肽的葡萄糖淀粉酶基因序列。1. 1. 3分別構建含異淀粉酶、兩種α淀粉酶和葡萄糖淀粉酶基因表達框架。①用PCR擴增巨大芽孢桿菌的本文檔來自技高網...

【技術保護點】
１．用枯草芽孢桿菌工程菌、畢赤酵母工程菌和釀酒酵母工程菌生產重組混合異淀粉酶、α淀粉酶和葡萄糖淀粉酶。其特征在于：通過分子生物學技術克隆解淀粉假單胞桿菌的異淀粉酶基因，地衣芽孢桿菌的α淀粉酶基因，大麥的α淀粉酶基因和黑曲霉菌的葡萄糖淀粉酶基因；通過構建表達載體，將以上所獲得的異淀粉酶、兩種α淀粉酶和葡萄糖淀粉酶基因重組于枯草芽孢桿菌基因組、畢赤酵母基因組和釀酒酵母基因組。用含以上所述的異淀粉酶、兩種α淀粉酶和葡萄糖淀粉酶基因的枯草芽孢桿菌工程菌、畢赤酵母工程菌和釀酒酵母工程菌生產重組混合異淀粉酶、α淀粉酶和葡萄糖淀粉酶。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：張愛聯，羅進賢，沈錦城，張添元，陳麗萍，劉振旺，張澤華，易國輝，
申請(專利權)人：中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所，羅進賢，
類型：發明
國別省市：66