高表達葡萄糖異構酶的重組鏈霉菌制造技術

本發明專利技術屬于基因工程領域，公開了一株高表達葡萄糖異構酶的重組鏈霉菌，該菌株分類命名為橄欖產色鏈霉菌(Streptomyces?olivochromogenes)，于2016年8月8日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號CGMCC?NO.12831。在鏈霉菌基因組中插入一段AO基因，再通過抗性篩選和發酵培養重組鏈霉菌。將經密碼子優化的AO基因，通過phic31整合酶整合入基因組，再通過抗性篩選和基因型篩選，得到重組鏈霉菌菌株。本發明專利技術整合入新的基因后，可提高18.7％葡萄糖異構酶基因的表達。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于基因工程領域，涉及一株高表達葡萄糖異構酶的重組鏈霉菌及其應用。
技術介紹
葡萄糖異構酶(GlucoseIsomerase,GI)，編號：EC5.3.1.5(木糖異構酶)。具有將醛糖異構化為相應酮糖(比如轉化葡萄糖成果糖)的活性。工業上普遍采用該酶，以葡萄糖漿為底物，將葡萄糖異構化為果糖后獲得果葡糖漿產品。葡萄糖異構酶的生產菌株多樣，諾維信報道用凝結芽孢桿菌和鼠灰鏈霉菌生產葡萄糖異構酶，杰能科報道用米蘇西里游動放線菌和銹赤鏈霉菌進行生產葡萄糖異構酶。國內曾經投入生產的菌株以山東省食品發酵工業研究設計院賀家明等人篩選出來的7號淀粉酶鏈霉菌為基礎，后經中國科學技術大學徐沖等人進行基因工程改造，在中科大易元生物技術有限公司產業化。用橄欖產色鏈霉菌生產葡萄糖異構酶早在1976年的US3957587里面已經提到，以橄欖產色鏈霉菌21114作為起始菌株，經紫外線照射誘變得到一系列的突變菌株，其中有幾株菌株的產酶能力得到大幅提高。但是對于橄欖產色鏈霉菌的基因組測序和葡萄糖異構酶基因的測序一直未見報道，關于該菌株的基因工程也未見報道。phic31重組酶發現后，有多篇文章將其應用到鏈霉菌的基因工程里面，pSET152載體為典型代表，其上面有phic31重組酶和attP位點，phic31重組酶可催化載體上的attP位點與基因組中的attB位點或假attB位點進行特異性重組，重組后可引導載體上的序列插入基因組中，由于潛在的多位點特異性重組，可能獲得經多位點整合后的多拷貝重組菌株。
技術實現思路
本專利技術的目的在于提供一株高表達葡萄糖異構酶的重組鏈霉菌株及其應用。旨在提高現有橄欖產色鏈霉菌菌株的葡萄糖異構酶酶活，使所構建的菌株更適合工業生產需要。該菌株分類命名為橄欖產色鏈霉菌(Streptomycesolivochromogenes)，于2016年8月8日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號CGMCCNO.12831。本專利技術的目的還在于提供一種構建高表達葡萄糖異構酶的重組鏈霉菌的方法。本專利技術的目的還在于提供一種葡萄糖異構酶基因及重組載體。本專利技術的目的還在于提供上述方法、基因及重組載體的應用。本專利技術的目的通過以下技術方案實現：一株高表達葡萄糖異構酶的重組鏈霉菌株，該菌株分類命名為橄欖產色鏈霉菌(Streptomycesolivochromogenes)，于2016年8月8日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號CGMCCNO.12831。上述的高表達葡萄糖異構酶的重組鏈霉菌株在生產葡萄糖異構酶中的應用。一種構建高表達葡萄糖異構酶的重組鏈霉菌的方法，在鏈霉菌基因組中的attB或假attB位點插入一段AO基因得到重組鏈霉菌；所述的AO基因是指經密碼子優化的葡萄糖異構酶基因，其基因序列如SEQIDNO.2所示。所述的AO基因上游可操作性連接雙啟動子，所述雙啟動子是由鏈霉菌強啟動子kasop和SF14構成，順序為kasop-SF14或SF14-kasop作為AO基因的啟動子啟動AO基因的表達。所述的雙啟動子kasop-SF14的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。具體構建步驟為：將雙啟動子kasop-SF14連接于AO基因上游，將重組得到的基因kasopSF14-AO插入pSET152載體中，構成重組整合載體pSET152-kasopSF14-AO；用接合轉移的方法將pSET152-kasopSF14-AO載體經大腸桿菌ET12567(pUZ8002)轉入橄欖產色鏈霉菌中得到重組鏈霉菌。一種序列優化的葡萄糖異構酶基因AO，其具有如SEQIDNO.2所示的核苷酸序列。一種重組載體，將上述的AO基因和雙啟動子kasopSF14插入pSET152載體中，構成的重組載體pSET152-kasopSF14-AO。上述的方法、葡萄糖異構酶基因或重組載體pSET152-kasopSF14-AO在提高橄欖產色鏈霉菌葡萄糖異構酶酶活和生產葡萄糖異構酶中的應用。一種生產葡萄糖異構酶的方法，發酵上述的重組鏈霉菌，得到葡萄糖異構酶。本專利技術所述的提高橄欖產色鏈霉菌葡萄糖異構酶基因表達的方法，通過phic31重組酶將一段葡萄糖異構酶基因AO插入橄欖產色鏈霉菌基因組中，抗性篩選得到陽性轉化子后，再通過發酵培養檢測葡萄糖異構酶酶活。具體的，將雙啟動子kasop-SF14連接于經密碼子優化后的AO基因上游，然后將得到的重組基因插入pSET152載體的XbaI和BamHI位點中，重組載體轉化大腸桿菌ET12567(pUZ8002)。經接合轉移大腸桿菌和橄欖產色鏈霉菌，用硫酸安普霉素進行抗性篩選。因為pSET152載體沒有鏈霉菌的復制起始位點，所以不能進行自我復制，抗性篩選中非重組的轉化子就會被篩選到，得到的轉化子就應該是整合了重組pSET152載體的重組菌，為了保險起見，我們用PCR(巢式PCR)的方法鑒定轉化子，確定轉化子里面有AO基因。用該方法我們也嘗試了插入其他基因，如來自游動放線菌的葡萄糖異構酶基因，都可以得到陽性轉化子。attB為一段核心為23bp的基因片段，由于鏈霉菌基因組中有attB和其他一些相似性比較高的序列，所以可能會形成多個位點的特異性整合，可以進行重復的接合轉化，以獲得更多拷貝的重組菌。使用非甲基化的大腸桿菌ET12567(pUZ8002)作為攜帶重組整合載體的供體菌來進行，比其他的甲基化大腸桿菌效率更高，在轉化后16-20h通過添加萘啶酮酸來殺死大腸桿菌，最后得到的轉化子都為鏈霉菌。再生培養基為2CMY培養基，接合轉化混合液涂抹在2CMY平板或MS平板上16-20h后用硫酸銨普霉素連同萘啶酮酸進行抗性篩選。硫酸安普霉素的濃度為25ug/ml。本專利技術所述的重組菌株的鑒定方法，是通過PCR和其他基因鑒定的方法，如果能夠獲得含有SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示的序列，則證明為本專利技術的重組菌株。本專利技術所述的重組基因和重組菌株在提高橄欖產色鏈霉菌葡萄糖異構酶酶活中應用。本專利技術的有益效果：本專利技術獲得了一株具有提高的葡萄糖異構酶生產能力和酶活的菌株。附圖說明圖1為重組載體pSET152-kasopSF14-AO的結構圖具體實施方式：下面結合實例對本專利技術的構建過程做進一步闡述，下述說明中相關實例是說明性質的，不能限定本專利技術的保護范圍。實施例1重組載體的構建在南京金斯瑞生物科技有限公司合成基因kasopSF14-AO，上下游分別帶有酶切位點XbaI和BamHI序列，然后插入pUC57的EcoRV位點中。用XbaI和BamHI雙酶切插入了kasopSF14-AO基因的pUC57載體。同時用XbaI和BamHI雙酶切pSET152載體。回收酶切產物后，用TAKALA的DNA連接酶I進行連接，轉化大腸桿菌DH5a，涂在含50ug/ml氨芐青霉素抗性的LB平板上進行抗性篩選。對得到的平板轉化子進行PCR鑒定，得到含有重組載體pSET152-kasopSF14-AO的大腸桿菌陽性轉化子，載體結構見圖1。實施例2重組載體轉化大腸桿菌ET12567(pUZ8002)從DH5a重組菌中提取質粒pSET152-kasopSF14-AO，通過CaCl2法化學轉化pSET152-kasopSF14-AO載體入大腸本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一株高表達葡萄糖異構酶的重組鏈霉菌株，該菌株分類命名為橄欖產色鏈霉菌(Streptomyces?olivochromogenes)，于2016年8月8日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號CGMCC?NO.12831。

【技術特征摘要】
1.一株高表達葡萄糖異構酶的重組鏈霉菌株，該菌株分類命名為橄欖產色鏈霉菌(Streptomycesolivochromogenes)，于2016年8月8日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號CGMCCNO.12831。2.權利要求1所述的高表達葡萄糖異構酶的重組鏈霉菌株在生產葡萄糖異構酶中的應用。3.一種構建高表達葡萄糖異構酶的重組鏈霉菌的方法，其特征在于在鏈霉菌基因組中插入一段AO基因得到重組鏈霉菌；優選的，所述的AO基因為一段經密碼子優化的葡萄糖異構酶基因序列，其基因序列如SEQIDNO.2所示。4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于所述的AO基因用kasop和SF14兩個鏈霉菌強啟動子構成雙啟動子kasop-SF14或SF14-kasop，啟動AO基因的表達。5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于所述的雙啟動子kasop-SF14的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。6.根據...

【專利技術屬性】
技術研發人員：劉明明，盧嫣紅，杜華東，李峰，
申請(專利權)人：南京百斯杰生物工程有限公司，
類型：發明
國別省市：江蘇;32