用嗜熱放線菌生產(chǎn)固定化葡萄糖異構(gòu)酶的方法及其用于高果糖漿的生產(chǎn)方法技術(shù)

用嗜熱放線菌生產(chǎn)固定化葡萄糖異構(gòu)酶的方法及其用于高果糖漿的生產(chǎn)方法是一種制酶及酶法制糖方法．該菌發(fā)酵條件粗放，較高溫不易污染，酶活３５０單位／毫升．胞外酶占總酶９０％．用離子交換樹脂掛酶，酶活８０００－１００００單位／克（干），總酶回收率６５－７０％，用酶法葡萄糖制得４２％高果糖漿轉(zhuǎn)化比為１：３０００．（*該技術(shù)在2005年保護過期，可自由使用*）

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)是關(guān)于葡萄糖異構(gòu)酶生產(chǎn)方法，特別是關(guān)于固定化葡萄糖異構(gòu)酶的生產(chǎn)方法及其用于生產(chǎn)高果糖漿的方法。酶法是使葡萄糖轉(zhuǎn)化為果糖的重要方法。以前國內(nèi)曾采用過液酶進行轉(zhuǎn)化，但是其產(chǎn)品質(zhì)量差、成本高，無法進行工業(yè)化生產(chǎn)。目前國內(nèi)外普遍采用的是固定化酶進行異構(gòu)化轉(zhuǎn)化，也就是使酶附著在一個不溶于水的固相載體上，形成固相酶，然后進行異構(gòu)化轉(zhuǎn)化。《特許公報》昭49-42555及50-17560介紹了一種先用嗜熱鏈霉菌Streptomyces YT-№6生產(chǎn)葡萄糖異構(gòu)酶，然后將培養(yǎng)液過濾，離心分離后收集到的菌體進行自溶等處理，得到酶液，再使酶掛到載體上進行異構(gòu)化的方法。該方法由于產(chǎn)生的酶多是胞內(nèi)酶，因此需要一套破壞細(xì)胞壁釋出酶的工藝及設(shè)備，并且此方法轉(zhuǎn)化比較低，1∶2000左右，因此其工藝較復(fù)雜，設(shè)備要求低，產(chǎn)率也較低。本專利技術(shù)的目的是改進固定化葡萄糖異構(gòu)酶的生產(chǎn)方法及其用于生產(chǎn)高果糖漿的方法，簡化工藝，減少設(shè)備，增加產(chǎn)率。本專利技術(shù)的方法為采用嗜熱放線菌Streptomyces M 1033(其寄存在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心寄存號為CGMCC№.0032)生產(chǎn)葡萄糖異構(gòu)酶，此酶中胞外酶占總酶量的90%。甲、所說明菌其培養(yǎng)特征為(1)察氏培養(yǎng)基生長良好，氣絲從乳白色到深灰色，基絲由白到黃褐色不形成可溶性色素。(2)淀粉瓊脂生長良好，氣絲由白色到灰色，基絲由乳白色到淺黃色不形成可溶性色素。(3)馬鈴薯浸汁生長良好，氣絲由白色到灰褐色，基絲由金黃色到淺褐色，不形成可溶性色素。(4)馬鈴薯塊生長一般，氣絲由白到淺灰色。(5)葡糖天冬素瓊脂生長良好，氣絲由白色到灰色，基絲由乳白色到淺黃色，不形成可溶性色素。(6)葡糖旦白胨瓊脂生長良好，氣絲由白到淺灰色，基內(nèi)菌絲由白色到淺褐色，不形成可溶性色素。乙、所說明菌的形態(tài)特征為45～50℃在高氏1號培養(yǎng)基上，生長良好，培養(yǎng)3天，氣絲由白色到灰色，培養(yǎng)3～5天，產(chǎn)生灰色胞子。菌落為園形，似傘狀，表面呈粉狀，胞子絲形狀為彎曲至形成螺旋。胞子形狀為園形、橢園形。丙、所說明菌的生理生化特征為(1)明膠培養(yǎng)基生長一般，液化明膠能力較弱。(2)牛奶培養(yǎng)基生長一般，對牛奶的凝固胨化能力較差。(3)淀粉水解瓊脂生長良好，能利用淀粉，氣生菌絲從白到灰白色，無可溶性色素形成。(4)酪氨酸瓊脂生長困難，少數(shù)菌落，氣絲由白到灰褐色，不形成可溶性色素，酪氨酸酶為陰性。(5)碳源利用能夠很好地利用淀粉、葡萄糖、果糖、蔗糖、木糖、鼠李糖、甘露醇、肌醇。很難利用棉子糖。均-態(tài)葡萄糖異構(gòu)酶的某些性質(zhì)清發(fā)酵液經(jīng)(NH4)2SO4淀沉透析脫鹽，DEAE-Sephadex A50柱和Sephadex G150柱提純，得均-態(tài)葡萄糖異構(gòu)酶，園盤電泳為一個區(qū)帶。酶蛋白組成為天冬氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、谷氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、胱氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、組氨酸、精氨酸等。比酶活為180.86單位/mg米氏常數(shù)Km為0.56M。此酶不但能將D-葡糖和D-果糖相互可逆轉(zhuǎn)化，也可將D-木糖和D-木酮糖，D-核糖和D-核酮糖相互可逆轉(zhuǎn)化。所說的菌首先在含有淀粉1～3%，KNO30.05～0.4%，MgSO40.01～0.1%，NaCl0.01～0.1%，K2HPO40.01～0.01%，F(xiàn)eSO40.001～0.005%的培養(yǎng)基上高溫35℃～55℃(范圍比實施例大一些)培養(yǎng)，其次再把上面得到的菌放入含麩夫3～8%，豆餅0.5～2%，MgSO40.05～0.2%，K2HPO40.05～0.2%，CoCl20.005～0.05%的培養(yǎng)基上通氣1∶0.1～1∶0.5高溫35～50℃培養(yǎng)種子。第三，把種子放入發(fā)酵罐內(nèi)，用含有麩皮3～8%，豆餅0.5～2%，MgSO40.05～0.2%，K2HPO40.05～0.2%，CoCl20.005～0.05%的培養(yǎng)基上通氣1∶0.1～1∶1高溫35～50℃發(fā)酵。第四步把前一步得到的發(fā)酵液過濾，得到清發(fā)酵液。第五步使清發(fā)酵液中的酶固定在載體上，特別是采用大孔強堿性苯乙烯系季胺基陰離子交換樹脂為載體吸附清發(fā)酵液中的酶，則得到了固定化葡萄糖異構(gòu)酶。使用所說的固定化酶接觸葡萄糖，則其部分被轉(zhuǎn)化為果糖。本專利技術(shù)的優(yōu)點是不用進行胞內(nèi)酶釋出處理等工序，因此簡化了工藝，減少了設(shè)備，并且轉(zhuǎn)化比高。附圖說明是本專利技術(shù)方法的具體工藝流程方框圖。異構(gòu)酶菌經(jīng)育種、發(fā)酵、壓濾、掛酶后即得到固定化異構(gòu)酶。然后把固相酶裝入柱狀轉(zhuǎn)化器，使葡萄糖通過轉(zhuǎn)化柱進入收集罐，載體樹脂經(jīng)一段時間使用后，還可再生，重新掛酶使用。下面的例子用于說明本專利技術(shù)，是本專利技術(shù)的最佳實施例，其工藝流程請參看附圖。第一步用所說的異構(gòu)酶菌在斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)。培養(yǎng)基成分為淀粉2%、硝酸鉀0.1%，硫酸鎂0.05%，氯化鈉0.05%，磷酸氫二鉀0.05%，硫酸亞鐵0.001%，溫度45～50℃，培養(yǎng)5～7天。第二步把所說的異構(gòu)酶菌放入種子罐中，在培養(yǎng)基上育種。培養(yǎng)基的成分為麩皮4%，豆餅1%，硫酸鎂0.1%，磷酸氫二鉀0.1%，氯化鈷0.024%，溫度40～42℃，通氣量1∶0.2～0.4，時間18小時。第三步把種子放入發(fā)酵罐，用上一步同樣的培養(yǎng)基及條件發(fā)酵65小時，所得發(fā)酵液的酶活為350單位/毫升。第四步把上一步所得發(fā)酵液不加助濾劑在40m2板框過濾機上過濾，每1m3發(fā)酵液過濾2～6小時，得清發(fā)酵液，其酶活占總酶活的90%。第五步用大孔強堿性苯乙烯系季胺基陰離子交換樹脂直接吸附清濾液中的異構(gòu)酶，形成固定化葡萄糖異構(gòu)酶。由此所得的異構(gòu)酶，其酶活可達8，000～10，000單位/g(干)，總酶的回收率可達65～70%。用此固相酶裝入指定管內(nèi)形成柱狀轉(zhuǎn)化器，再在基質(zhì)酶法葡萄糖液DE95%以上，電阻率5，000～50，000Ωcm，濃度30～50%，溫度55～65℃的條件下，使此葡萄糖溶液通過轉(zhuǎn)化器，則有42%的葡萄糖轉(zhuǎn)化為果糖，酶的轉(zhuǎn)化比為1∶3，000再經(jīng)離子交換和真空濃縮后可得71%的干物質(zhì)。補正 85100412文件名稱 頁 行 補正前 補正后說明書 1 7 …昭49-42555 …昭49-42555及50-17560… 及昭50-17560…1 倒7 設(shè)備要求低，產(chǎn)率也較 設(shè)備要求多，產(chǎn)率也較低。 低。本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護點】
用嗜熱放線菌生產(chǎn)固定化葡萄糖異構(gòu)酶的方法：第一步：把嗜熱放線菌放在含有淀粉、硝酸鉀、硫酸鎂、氯化鈉、磷酸氫二鉀、硫酸亞鐵的培養(yǎng)基上高溫培養(yǎng)。第二步：把前一步得到的嗜熱放線菌放在含有麩皮、豆餅、硫酸鎂、磷酸氫二鉀、氯化鈷的培養(yǎng)基上通氣 高溫培養(yǎng)種子。第三步：把種子放入發(fā)酵罐內(nèi)，用含有麩皮、豆餅、硫酸鎂、磷酸氫二鉀、氯化鈷的培養(yǎng)基上通氣高溫發(fā)酵。第四步：把前一步得到的發(fā)酵液過濾，得清發(fā)酵液。第五步：使清發(fā)酵液中的酶固定在載體上。其特征在于所說的嗜熱放線菌是寄 存在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心寄存號為ＣＧＭＣＣ№．００３２的嗜熱放線菌ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓＭ１０３３。甲、所說明菌其培養(yǎng)特征為：（１）察氏培養(yǎng)基：生長良好，氣絲從乳白色到深灰色，基絲由白到黃褐色，不形成可溶性色 素。（２）淀粉瓊脂：生長良好，氣絲由白色到灰色，基絲由乳白色到淺黃色，不形成可溶性色素。（３）馬鈴薯浸汁：生長良好，氣絲由白色到灰褐色，基絲由金黃色到淺褐色，不形成可溶性色素。（４）馬鈴薯塊：生長一般，氣絲由白到淺灰色。（５ ）葡糖天冬素瓊脂：生長良好，氣絲由白色到灰色，基絲由乳白色到黃色，不形成可溶性色素。　（６）葡糖蛋白胨瓊脂：生長良好，氣絲白到淺灰色，基內(nèi)菌絲由白色到淺褐色，不形成可溶性色素。乙、所說明菌的形態(tài)特征為：４５°～５０℃在高氏１號培養(yǎng)基 上生長良好，培養(yǎng)３天，氣絲由白色到灰色，培養(yǎng)３～５天，產(chǎn)生灰色胞子。菌落為園形，似傘狀，表面呈粉狀，胞子絲形狀為：彎曲至形成螺旋，胞子形狀為：園形、橢園形。丙、所說明菌的生理生化特征為：（１）明膠培養(yǎng)基：生長一般，液化明膠能力較弱。　（ ２）牛奶培養(yǎng)基：生長一般，對牛奶的凝固胨化能力較差。（３）淀粉水解瓊脂：生長良好，能利用淀粉，氣生菌絲從白到灰白色，無可溶性色素形成。（４）酪氨酸瓊脂：生長困難，少數(shù)菌落，氣絲由白到灰褐色，不形成可溶性色素，酪氨酸酶為陰性。（５ ）碳源利用：能夠很好地利用淀粉、葡萄糖、果糖、蔗糖、木糖、鼠李糖、甘露糖、肌糖。很難利用棉子糖。均一態(tài)葡萄糖異構(gòu)酶的某些性質(zhì)：清發(fā)酵液經(jīng)（ＮＨ↓〔４〕）↓〔２〕ＳＯ↓〔４〕沉淀透析脫鹽，ＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ａ↓〔５０〕柱和Ｓｅｐ ｈａｄｅｘ　Ｇ↓〔１５０〕柱提純，得均一態(tài)葡萄糖異構(gòu)糖，園盤電泳為一個區(qū)帶。酶蛋白組成為：天冬氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、谷氨酸、脯...

【技術(shù)特征摘要】
1.用嗜熱放線菌生產(chǎn)固定化葡萄糖異構(gòu)酶的方法第一步把嗜熱放線菌放在含有淀粉、硝酸鉀、硫酸鎂、氯化鈉、磷酸氫二鉀、硫酸亞鐵的培養(yǎng)基上高溫培養(yǎng)。第二步把前一步得到的嗜熱放線菌放在含有麩皮、豆餅、硫酸鎂、磷酸氫二鉀、氯化鈷的培養(yǎng)基上通氣高溫培養(yǎng)種子。第三步把種子放入發(fā)酵罐內(nèi)，用含有麩皮、豆餅、硫酸鎂、磷酸氫二鉀、氯化鈷的培養(yǎng)基上通氣高溫發(fā)酵。第四步把前一步得到的發(fā)酵液過濾，得清發(fā)酵液。第五步使清發(fā)酵液中的酶固定在載體上。其特征在于所說的嗜熱放線菌是寄存在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心寄存號為CGMCC№·0032的嗜熱放線菌StreptomycesM1033。甲、所說明菌其培養(yǎng)特征為(1)察氏培養(yǎng)基生長良好，氣絲從乳白色到深灰色，基絲由白到黃褐色，不形成可溶性色素。(2)淀粉瓊脂生長良好，氣絲由白色到灰色，基絲由乳白色到淺黃色，不形成可溶性色素。(3)馬鈴薯浸汁生長良好，氣絲由白色到灰褐色，基絲由金黃色到淺褐色，不形成可溶性色素。(4)馬鈴薯塊生長一般，氣絲由白到淺灰色。(5)葡糖天冬素瓊脂生長良好，氣絲由白色到灰色，基絲由乳白色到黃色，不形成可溶性色素。(6)葡糖蛋白胨瓊脂生長良好，氣絲白到淺灰色，基內(nèi)菌絲由白色到淺褐色，不形成可溶性色素。乙、所說明菌的形態(tài)特征為45°～50℃在高氏1號培養(yǎng)基上生長良好，培養(yǎng)3天，氣絲由白色到灰色，培養(yǎng)3～5天，產(chǎn)生灰色胞子。...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：賀家明，袁建國，
申請(專利權(quán))人：山東省食品發(fā)酵工業(yè)研究所，
類型：發(fā)明
國別省市：37[中國|山東]