本發明專利技術涉及雜交細胞和用于生產雜交細胞的方法。具體地，本發明專利技術涉及從至少3個細胞的雜交產生的雜交細胞，其中至少2個細胞源自不同的譜系。本發明專利技術另外涉及雜交細胞用于表達蛋白的應用，所述蛋白可用于多種診斷用途、預防用途、治療用途和/或研究用途。
【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】
本專利技術涉及雜交細胞和用于生產雜交細胞的方法。具體地,本專利技術涉及從至少3 個細胞的雜交產生的雜交細胞，其中至少2個細胞源自不同的譜系。本專利技術另外涉及雜交細胞用于表達蛋白的應用，所述蛋白可用于多種診斷用途、預防用途、治療用途和/或研究用途。
技術介紹
在本說明書自始至終對現有技術的任何討論，絕不能視作承認這樣的現有技術是廣泛已知的，或形成本領域的普通一般常識的一部分。多種不同的細胞類型目前被用于表達蛋白，所述蛋白在商業上與多種診斷用途、 預防用途、治療用途和/或研究用途有關。目前，這樣的蛋白的生產常規地在細胞中進行， 所述細胞例如細菌、酵母、真菌、昆蟲和非人哺乳動物細胞。細胞經常以多種翻譯后修飾來修飾蛋白，所述翻譯后修飾包括、但不限于糖基化、酰化、磷酸化、甲基化、硫酸化、異戍二烯化和脂質化(Iipidation)。這些修飾是物種特異性的，且因而，目前用于生產商業上有關的蛋白的細胞表現出這樣的翻譯后修飾所述修飾不同于在從人細胞表達的蛋白或在人體中天然存在的蛋白上觀察到的翻譯后修飾。例如，許多用于生產商業上有關的蛋白的非哺乳動物細胞類型要么缺少糖基化蛋白的能力， 要么表現出這樣的糖基化模式所述模式不同于在人細胞中表達的蛋白所表現出的糖基化模式。甚至在非人哺乳動物表達系統諸如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞中，確證了與人細胞相比糖基化模式的顯著差異。例如，用于重組蛋白表達的CHO細胞系缺乏功能性的(α2， 6)唾液酸轉移酶，該酶用于合成在人細胞中存在的(α 2，6)-連接的末端唾液酸。此外， 在CHO-細胞表達的糖蛋白上存在的唾液酸基序易于被CHO細胞內源性的唾液酸酶降解 (Gramer 等人 Biotechnology 13(7) :692_&，1995)。作為非人表達系統的不同翻譯后修飾譜(repertoires)的結果，由它們表達的蛋白可能表現出不同于人細胞-衍生的蛋白的生理化學特征和藥理學特征，諸如半衰期、免疫原性、穩定性和功能性的功效。這可以在很大程度上影響這些蛋白的臨床效用。還有日益增多的證據表明，除了它的物種-依賴性的性質以外，在相同的物種內， 翻譯后修飾也可以是組織特異性的，甚至是細胞類型特異性的。這具體地與表現出終末糖基化的蛋白的組織特異性的表達和細胞類型特異性的表達有關(Feizi Nature 314 53-54,1985 ;Rademacher 等人 Annu Rev Biochem 57 :785-838,1988)。具體地，已經表明， 3種唾液酸轉移酶(它們將末端唾液酸附著至糖蛋白糖鏈上)表現出在大鼠的7種組織中顯著不同的表達(Paulson等人J. Biol. Chem. 264 :10931-10934，1989)。這為相同蛋白的組織特異性的糖基化提供了支持。此外，使用由來自骨髓的小鼠成纖維細胞和小鼠成骨細胞表達的高度磷酸化的糖蛋白(小鼠骨橋蛋白)的兩種同工型的研究，表現出它們的磷酸化程度的主要差異，這與生物活性的差異有關。這些結果提示，由不同的細胞類型生產的骨橋蛋白的功能是不同的(Christensen 等人 J Biol. Chem. 282(27) : 19463-19472)。適用于生產表現出全人特征的生物制品的有效的細胞系統理想地應當滿足許多標準，包括、但不限于a)源自人組織；b)在培養中高密度生長；c)表現出商業上可行的蛋白得率；d)允許穩定的外來基因導入；e)允許基因擴增方法；f)允許使用親本細胞進行單克隆抗體生產，如在人-人雜交瘤中；g)表現出穩定的長期蛋白表達；h)在無血清的和無谷氨酰胺的培養基中生長的能力；i)缺乏內肽酶活性，從而減少蛋白降解，j)不含有致病劑，包括病毒DNA和支原體；k)生產表現出翻譯后修飾的蛋白，所述翻譯后修飾在功能上與在天然存在的人蛋白上發生的翻譯后修飾類似或相同，優選地是組織和細胞特異性的。這些翻譯后修飾可以包括、但不限于糖蛋白上的碳水化合物部分。盡管存在許多用于表達人蛋白的人宿主細胞或異源雜交瘤(heterohybridomas), 但它們都沒有成功地滿足所有上述標準。最值得注意的是，從現有的人細胞表達系統以臨床上有用的得率表達和分離蛋白的嘗試，已經導致有限的成功。真核細胞中的蛋白表達在多個階段受到控制，所述階段包括(a)調節因子對染色質中的基因的影響；(b)轉錄起始的調節；和(c)翻譯后修飾。認為這些不同的階段是發育階段特異性的和/或組織特異性的。因而，當將編碼所需蛋白的外源基因摻入細胞中時，所需蛋白的表達可能小于最佳量。可能產生問題，諸如缺乏穩定的表達(Li等人，Proc Natl Acad Sci USA 95 :3650-3654,1998 ;Miyaji 等人，Cytotechnology，3 :133_140，1990 ; Miyaji 等人，Cytotechnology 4 :173-180,1990 ；Miyaji 等人，Cytotechnology 4 :39-43, 1990 ;Satoh 等人，Cytotechnology 13 :79_88，1993)、低表達得率(Airoldi 等人，Cancer Research 61 :1285-1290，2001 ；Hosoi 等人 Cytotechnology 7 :25-32,1991)和非最佳的翻譯后修飾(Shinkawa等人，J. Biol. Chem. 278 =3466-3473,2003)。所有這些因素都可能影響蛋白的潛在商業效用。作為一個實例，Namalwa細胞(在懸浮培養物中生長并適應沒有血清和清蛋白的培養基的人B類淋巴母細胞)的一個亞系Namalwa KJM-1,被用于大規模生產α-干擾素， 后者是伯基特氏淋巴瘤細胞的內源蛋白。但是，當將G-CSF蛋白(它對于伯基特氏淋巴瘤細胞而言是外來的，但是對于B細胞而言是內源的(Airoldi等人，Cancer Research 61 1285-1290,2001))用作經由電穿孔的轉染的靶向蛋白時，G-CSF表達水平在多個氨甲蝶呤 (MTX)抗性的克隆中存在不同，且最高的G-CSF生產克隆具有僅2. 4μ g/ml/天的比生產率 (當適應無血清的條件時)。此外，當細胞數目超過7xl05細胞/ml時，高密度培養抑制比生產率(Hosoi等人 Cytotechnology 7 :25-32,1991)。即使報道的最大G-CSF濃度顯著提高并達到41 μ g/ml, 但為了實現它，需要廣泛地并費力地操縱細胞培養條件，其中非常嚴緊地控制pH。也表明用于最佳生長的培養基不同于用于最佳生產的培養基，因而產生希望的高密度和高生產率之間的明顯沖突，并導致工業上不可行的系統。因為真核生物中的基因表達在多個步驟中受到控制，所述步驟包括(a)染色質中的基因的調節因子的可用性和可接近性；(b)對特定轉錄起始速率的可及啟動子的調節；和(c)隨后在不同的步驟處的轉錄后事件，組織特異性的和發育特異性的轉錄因子的存在對基因的表達具有很大影響。此外，特定細胞類型的基因調節需要幾種順式作用的DNA調節序列的協同作用，所述調節序列是將分子信號傳遞給基因的蛋白的結合位點 (Blackwood等人,Science 281 :6本文檔來自技高網...
【技術保護點】
【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】...
【專利技術屬性】
技術研發人員：G·卡塞科，T·L·馬哈沃拉西爾帕，
申請(專利權)人：BTS研究國際股份有限公司，
類型：發明
國別省市：
還沒有人留言評論。發表了對其他瀏覽者有用的留言會獲得科技券。