與二氫黃豆苷元合成有關的酶制造技術

本發明專利技術的目的在于提供一種與二氫黃豆苷元合成有關的酶、編碼上述酶的基因、及使用上述酶和基因制備二氫黃豆苷元的方法。本發明專利技術提供二氫黃豆苷元合成酶、四氫黃豆苷元合成酶及雌馬酚合成酶和編碼上述酶的基因。并且，本發明專利技術提供一種使用上述酶合成二氫黃豆苷元、四氫黃豆苷元及/或雌馬酚的方法。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及一種具有以黃豆苷元為底物合成二氫黃豆苷元活性的多肽、一種具有以二氫黃豆苷元為底物合成四氫黃豆苷元活性的多肽、及一種具有以四氫黃豆苷元為底物合成雌馬酚活性的多肽，并且涉及一種編碼上述多肽的多核苷酸。并且，本專利技術涉及一種使用上述多肽制備二氫黃豆苷元、四氫黃豆苷元及雌馬酚的制備方法及在上述過程中使用的制備裝置，本專利技術還提供一種與上述內容相關的技術。
技術介紹
一直以來，通常認為異黃酮衍生物具有多種生理學和藥學活性，被用作食品原料和藥品原料。但是，隨著與異黃酮衍生物有關的功能的闡明，有報道指出并不是一直以來所 認為的僅異黃酮衍生物具有雌激素樣活性，而是上述衍生物在各種腸內細菌的作用下在菌體內被代謝(生物合成)后生成了具有更強雌激素樣作用的雌馬酚，上述雌馬酚被釋放到菌體外，之后被腸吸收而在全身發揮雌激素作用。然而，并非所有人都有在腸內產生雌馬酚的能力，雌馬酚的產生能力因人而異。例如，有些人在腸內沒有雌馬酚產生菌，而有些人雖然在腸內有雌馬酚產生菌但其雌馬酚產生能力較低。因此，在體內有效利用雌馬酚對于面臨高齡化社會的日本等是重要的，特別是從應對以骨質疏松為代表的慢性老年性疾病方面考慮也是重要的。并且，考慮到如上所述的有些人內在地含有雌馬酚產生腸內細菌而有些人卻沒有的這一現實，需要研制一種能有效地人工生產雌馬酚的雌馬酚合成原料。在上述背景下，從提供一種雌馬酚合成原料這方面考慮，與上述生物合成通路有關的酶的鑒定及其使用是極其重要的。但是，對于生產或催化在上述生物合成通路中相關的幾個中間體的酶，尚無任何相關信息，因此人們期望能夠鑒定相關酶。專利文獻I :日本特開2006-296434號公報
技術實現思路
本專利技術的目的在于提供一種與用作雌馬酚合成原料的二氫黃豆苷元的合成有關的酶。具體而言，本專利技術的目的在于提供具有以黃豆苷元為底物合成二氫黃豆苷元活性的多肽。并且，本專利技術的目的在于提供編碼上述多肽的多核苷酸及與利用該多肽合成二氫黃豆苷元相關的技術等。另外，本專利技術的目的在于提供與用作雌馬酚合成原料的四氫黃豆苷元的合成有關的酶。具體而言，本專利技術的目的在于提供具有以二氫黃豆苷元為底物合成四氫黃豆苷元活性的多肽。并且，本專利技術的目的在于提供編碼上述多肽的多核苷酸及與利用該多肽合成四氫黃豆苷元相關的技術等。進而，本專利技術的目的在于提供與雌馬酚合成有關的酶。具體而言，本專利技術的目的在于提供具有以四氫黃豆苷元為底物合成雌馬酚活性的多肽。并且，本專利技術的目的在于提供編碼上述多肽的多核苷酸及與利用該多肽合成雌馬酚相關的技術等。進而，本專利技術的目的在于提供在由黃豆苷元制備雌馬酚時所生成的二氫黃豆苷元和四氫黃豆苷元的制備方法即中間體的制備方法，及能夠利用所得的中間體制備雌馬酚的制備方法。并且，本專利技術的目的在于提供在上述制備中使用的制備裝置。本專利技術人等為了解決上述課題進行了潛心研究，結果成功地從雌馬酚產生腸內細菌中分離出能夠合成二氫黃豆苷元的酶、能夠合成四氫黃豆苷元的酶及能夠合成雌馬酚的酶，用作合成雌馬酚的原料，并闡明了上述酶的結構。另外，本申請專利技術人等通過進一步的研究，利用上述酶成功地人工制備出二氫黃豆苷元、四氫黃豆苷元及雌馬酚。基于上述發現并經過進一步改良完成了本專利技術。gp，本專利技術提供下述專利技術 項AL選自以下(Aa) (Ac)中的多肽(Aa)多肽，由序列號I所示的氨基酸序列組成；(Ab)多肽，由在序列號I所示的氨基酸序列中取代、缺失、插入及/或添加一個或多個氨基酸得到的氨基酸序列組成，并且具有以黃豆苷元為底物合成二氫黃豆苷元的活性；(Ac)多肽，由與序列號I所示的氨基酸序列具有60%以上同一性的氨基酸序列組成，并且具有以黃豆苷元為底物合成二氫黃豆苷元的活性。項A2.選自以下(Ad) (Af)中的多核苷酸(Ad)多核苷酸，由序列號4所示的核苷酸序列組成；(Ae)多核苷酸，編碼由序列號I所示的氨基酸序列組成的多肽；(Af)多核苷酸，與上述(Ad)或(Ae)的多核苷酸的互補鏈在嚴格條件下雜交，并且編碼具有以黃豆苷元為底物生成二氫黃豆苷元活性的多肽。項A3. —種表達載體,含有項A2所述的多核苷酸。項A4. —種重組細胞，是由項A3所述的表達載體轉化得到的。項A5.如項A4所述的重組細胞,該重組細胞為細菌性原核細胞。項A6.如項A5所述的重組細胞，其中，細菌性原核細胞屬于乳球菌屬。項A7. —種多肽的制備方法，所述方法包括培養項A4至A6中任一項所述的細胞，得到具有以黃豆苷元為底物生成二氫黃豆苷元活性的多肽的步驟。項A8. —種多肽，由項A7所述的制備方法得到。項A9. —種二氫黃豆苷兀的制備方法,所述方法包括使項A I或A8所述的多肽、及NADPH及/或NADH作用于黃豆苷元的步驟。項A10. —種二氫黃S 苷兀的制備方法,所述方法包括使項A4至A6中任一項所述的細胞作用于黃豆苷元的步驟。項All. —種抗體，所述抗體與項Al所述的多肽或由項A2所述的多核苷酸編碼的多肽具有親和性。項A12. —種免疫學方法，用于檢測或測定項Al所述的多肽或由項A2所述的多核苷酸編碼的多肽，所述方法包括使受試樣品與項A 11所述的抗體相接觸的步驟。項A13.如項A12所述的方法，其中，用作檢測或測定對象的多肽存在于細菌性原核細胞內。項A14. —種探針，所述探針含有能與編碼項A I所述多肽的多核苷酸或項A2所述多核苷酸在嚴格條件下雜交的核苷酸序列。項A15. —種引物，所述引物含有能與編碼項A I所述多肽的多核苷酸或項A2所述多核苷酸在嚴格條件下雜交的核苷酸序列。項A16. —種使用項A14所述的探針檢測或測定編碼項Al所述的多肽的多核苷酸或項A2所述的多核苷酸的方法。項A17.如項A16所述的方法，其中，用作檢測或測定對象的多肽存在于細菌性原核細胞內。項A18.如項A16所述的方法，包括使用PCR擴增全部或部分編碼Al所述多肽的 多核苷酸或項A2所述的多核苷酸的步驟。項A19. —種二氫黃豆苷元合成酶組合物，其特征在于，含有項Al所述的多肽或項A2的多核苷酸編碼的多肽。項A20.如項A19所述的組合物，所述組合物進一步含有NADPH及/或NADH。項A21. —種二氫黃豆苷兀合成原料組合物,其特征在于,含有(Ai)項Al所述的多肽或項A2的多核苷酸編碼的多肽； (Aii) NADPH 及 / 或 NADH ;及(Aiii)黃豆苷元。項A22. —種二氫黃豆苷兀合成原料組合物,其特征在于,含有(Aiv)項A4至A6中任一項所述的細胞；及(Aiii)黃豆苷元。項A23. —種二氫黃豆苷兀合成用試劑盒,所述試劑盒含有(Ai)項Al所述的多肽或項A2的多核苷酸編碼的多肽；(Aii) NADPH 及 / 或 NADH ;及(Aiii)黃豆苷元。項A24. —種二氫黃豆苷兀合成用試劑盒,所述試劑盒含有(Aiv)項A4至A6中任一項所述的細胞；及(Aiii)黃豆苷元。項A25. —種免疫學測定用試劑盒，用于測定項Al所述的多肽或項A2的多核苷酸編碼的多肽，所述試劑盒至少含有項All所述的抗體。項A26. —種PCR用試劑盒，用于檢測編碼項A I所述多肽的多核苷酸或項A2所述的多核苷酸，所述試劑盒至少含有項A15所述的引物。項A27.如項A26所述的鑒定用試劑盒，所述試劑本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
2007.12.27 JP 2007-336227;2008.03.05 JP 2008-054871.一種多肽，所述多肽具有以黃豆苷元為底物合成ニ氫黃豆苷元的活性。2.如權利要求I所述的多肽，所述多肽以NADPH或NADH作為輔酶顯示所述活性。3.如權利要求I或2所述的多肽，所述多肽的最適溫度在30°C左右。4.如權利要求I 3中任一項所述的多肽，所述多肽的最適pH為7.O。5.如權利要求I 4中任一項所述的多肽，所述多肽通過SDS-PAGE測定的分子量約為70kDa。6.如權利要求I 5中任一項所述的多肽，所述多肽為來自擬桿菌、鏈球菌、或乳球菌的多肽。7.如權利要求I 6中任一項所述的多肽,所述多肽為下述(Aa) (Ac)中的任ー種， (Aa)多肽，由序列號I所示的氨基酸序列組成； (Ab)多肽，由在序列號I所示的氨基酸序列中，取代、缺失、插入及/或添加選自下述位置的I 15個氨基酸得到的氨基酸序列組成，并且具有以黃豆苷元為底物合成ニ氫黃豆苷元的活性， 所述位置為第45位的亮氨酸、第80位的天冬酰胺、第167位的纈氨酸、第231位的天冬氨酸、第233位的異亮氨酸、第435位的精氨酸、第459位的天冬氨酸、第462位的纈氨酸、第528位的精氨酸、第540位的絲氨酸、及第639位的異亮氨酸、及它們的前后3個的氨基酸的位置； (Ac)多肽，由與序列號I所示的氨基酸序列具有98%以上同一性的氨基酸序列組成，并且具有以黃豆苷元為底物合成ニ氫黃豆苷元的活性。8.如權利要求I 7中...

【專利技術屬性】
技術研發人員：島田良和，保田世津子，高橋真行，林隆史，宮澤憲浩，阿比留康弘，
申請(專利權)人：大塚制藥株式會社，
類型：發明
國別省市：