本發明專利技術屬生物技術領域，涉及一種多肽修飾的腦靶向納米器件及制備方法和用途；該納米器件由陽離子樹枝狀大分子材料、激活型Caspase-3特異性反應元件、淬滅劑和具有腦靶向作用的狂犬病毒糖蛋白衍生多肽RVG29組成；以RVG29作為腦靶向頭基，陽離子樹狀大分子為載體材料，通過雙功能連接劑連接RVG29構建腦靶向載體。本發明專利技術的多肽修飾的腦靶向納米器件利用受體介導的穿細胞作用穿過血腦屏障到達腦內，可與神經元表面的特異性受體進行結合，實現納米器件向神經元的富集，有利于檢測神經元內的細胞凋亡情況。所述的納米器件在體內應用時，不僅確證激活型Caspase-3的存在與否，還可實現激活型Caspase-3的存在量比較。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬生物
，涉及一種多肽修飾的腦靶向納米器件，具體涉及一種由狂犬病毒糖蛋白衍生多肽修飾的腦靶向納米器件及制備方法和用途，尤其涉及一種由狂犬病毒糖蛋白衍生多肽修飾的腦靶向納米器件及制備方法和其在腦內激活型Caspase-3成像中的應用。
技術介紹
神經退行性疾病包括阿爾茨海默病和帕金森病是具有較高發病率和死亡率的一類疾病，具有病程長，進展性，缺乏明確的診斷測試等特點，且在出現明顯癥狀如運動障礙等之前，已經伴隨有一些列的病理特征包括不可逆的神經元死亡等發生；因此，早期的檢測和診斷對于治療這類疾病至關重要，尤其是延緩和阻止神經元的死亡。神經退行性疾病發生時腦部的改變通常在化學水平，不易于被磁共振成像(MRI)以及斷層掃描(CT)發現；在神經退行性疾病早期對其進行診斷充滿挑戰。此外，血腦屏障的存在雖然在一方面維持了中樞神經系統的穩態，但同時它也阻礙了治療和診斷藥物通過全身給藥方式遞釋入腦內，尤其是對于大分子藥物。現有技術公開了有關神經元死亡是神經退行性疾病的典型特征；因此，發現異常和凋亡的神經細胞并給予及時的治療顯得尤為重要。有研究發現，由Caspase介導的凋亡途徑在慢性神經退行性疾病中介導細胞死亡發揮著重要的作用；而Caspase-3的激活在神經細胞的凋亡中普遍存在。雖然，引起這類疾病的確切機制還尚未明確，但Caspase-3激活途徑的參與已獲得廣泛共識。所述的Caspase-3通常在細胞內以非活性32k道爾頓分子量的酶原形式存在；在凋亡發生時，上游的蛋白酶信號可將其裂解為12k和17k道爾頓的亞單位。有報道證明了激活型Caspase-3陽性的黑質多巴胺能神經元比例在帕金森病中明顯升高；因此，實現激活型Caspase-3的體內檢測，將會有益于監測潛在的神經元損傷，并及時給予干預。為了達到上述目的，診斷試劑必須具備跨過血腦屏障的能力。所述的血腦屏障主要是由腦毛細血管內皮細胞組成的緊密連接，使得絕大多數分子難以從血液進入腦內。目前，由受體介導的內吞途徑因其具有較高的選擇性和透過效率，而更多的被應用于藥物遞釋系統的跨血腦屏障轉運策略中；同時，由狂犬病毒糖蛋白衍生的29個氨基酸多肽(RVG29)，在前期的研究中，已經被證明是一種高效的腦靶向頭基介導藥物的跨血腦屏障遞釋。研究證實，聚左旋賴氨酸樹枝狀分子(DGLs)是一類新型的納米級尺寸、具有可降解性的聚合物，其單體是左旋賴氨酸，由可降解的酰胺鍵連接，末端具有豐富的氨基，可被進一步修飾。利用DGLs的特點結合近年來研究較為廣泛的熒光共振能量轉移(FRET)技術可構建腦靶向性的納米器件，實現腦內激活型Caspase-3的成像。將熒光探針Cy5標記的含有激活型Caspase-3識別的底物序列(DEVD)的多肽通過雙功能連接劑可共價連接于DGLs的表面，同時采用Cy5的淬滅劑QSY21，以非線性的方式連接于DGLs表面，通過控制合成的比例，可達到高效的分子間淬滅，進而降低背景熒光信號的干擾。采用RVG29腦靶向頭基的修飾，可通過受體介導的跨血腦屏障轉運，使得納米器件可進入腦內發揮作用；但目前尚未見有關RVG29修飾的腦靶向納米器件報道。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供一種多肽修飾的腦靶向納米器件，尤其涉及一種由狂犬病毒糖蛋白衍生多肽修飾的腦靶向納米器件 及制備方法。本專利技術的另一目的是提供所述的腦靶向納米器件在腦內激活型Caspase-3成像中的應用。本專利技術的腦靶向納米器件結合主動靶向和熒光共振能量轉移技術，進行腦內激活型Caspase-3的成像，能為神經退行性疾病的早期診斷提供重要依據。具體而言，本專利技術的多肽修飾的腦靶向納米器件，其特征在于，由陽離子樹枝狀大分子材料、激活型Caspase-3特異性反應元件、淬滅劑和具有腦靶向作用的狂犬病毒糖蛋白衍生的29氨基酸多肽RVG299組成；所述的狂犬病毒糖蛋白衍生的29氨基酸多肽RVG29作為腦靶向頭基，陽離子樹狀大分子為載體材料，通過雙功能連接劑連接RVG29構建腦靶向載體。本專利技術中，所述的陽離子樹枝狀大分子材料選自聚左旋賴氨酸樹枝狀分子(DGLs)和聚酰胺 _ 胺(polyamidoamine,簡稱 PAMAM)；本專利技術中，所述的雙功能連接劑為Sulfo-LC-SMPT ；本專利技術中，所述的激活型Caspase-3特異性反應元件選自Cy5標記的含有DEVD序列的多肽，其序列為CGDEVDAPK(Cy5)；所述的Cy5熒光的淬滅劑為QSY21。本專利技術中，所述的狂犬病毒糖蛋白衍生的29氨基酸多肽RVG29，具有SEQ ID NO. I的序列。本專利技術中，以陽尚子樹枝狀大分子材料、Cy5標記的含有DEVD序列的多肽、QSY21和多肽RVG29為組分，Cy5標記的含有DEVD序列的多肽和RVG29通過雙功能連接劑Sulfo-LC-SMPT以共價方式連接樹狀大分子載體，QSY21直接共價連接于樹枝狀分子載體，構建腦靶向載體，其中，所述的Cy5標記的含有DEVD序列的多肽與陽離子樹狀大分子材料的分子比是I 10 I ；所述的QSY21與Cy5標記的含有DEVD序列的多肽的分子比為5 10 I ；所述的RVG29多肽與陽離子樹狀大分子材料的分子比是I 10 I。本專利技術提供了制備多肽修飾的腦靶向納米器件的方法，其特征在于，其包括陽離子樹枝狀大分子材料和雙功能連接劑Sulfo-LC-SMPT以I : I 70的分子比溶于PH值7. 4的磷酸鹽緩沖液中，室溫攪拌反應60 180分鐘，陽離子樹枝狀大分子表面的氨基與Sulfo-LC-SMPT的琥珀酰亞胺發生特異性反應，以含有EDTA的pH值7. 4的磷酸鹽緩沖液透析過夜除去未反應的連接劑；Cy5標記的含有DEVD序列的多肽和RVG29多肽末端連有半胱氨酸引入巰基，分別以I 15 I和I 10 I的分子比與陽離子樹狀大分子材料-Sulfo-LC-SMPT連接物上的特異基團室溫攪拌反應12 72小時后生成腦靶向陽離子樹狀大分子_Cy5標記的含有DEVD序列的多肽復合物，分子排阻色譜法除去未反應的多肽，凍干去除溶劑；在pH值7. 4 8. 5的磷酸鹽緩沖液中進一步用含有琥珀酰亞胺的QSY21直接與陽離子樹枝狀大分子表面的氨基按照分子比5 100 : I的比例反應，構建成腦革巴向激活型Caspase-3體內成像納米器件。本專利技術的腦靶向激活型Caspase-3體內成像納米器件適用于腦部含有激活型Caspase-3 的成像。本專利技術中，所述的腦祀向載體上通過雙功能連接劑連接若干個Cy5標記的含有DEVD序列的多肽，再利用琥珀酰亞胺功能化的QSY21直接連接于陽離子樹枝狀大分子表面，通過控制合成比例達到完全淬滅Cy5的熒光，可明顯降低背景熒光信號的干擾，在激活型Caspase-3存在的細胞中，DEVD可特異性被識別并裂解，釋放Cy5熒光，該信號可進一步被活體成像儀等檢測，實現腦內的激活型Caspase-3成像。本專利技術采用活體成像儀系統對QSY21連接的淬滅反應進行監測，結果顯示，QSY21 與Cy5修飾的多肽的分子比為I : 7時，可達到高效的分子間淬滅；本專利技術采用紫外-可見光分光光度法分別測定了陽離子樹枝狀大分子、Cy5標記的含有DEVD序列的多肽以及腦靶向激活型Caspase-3本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種多肽修飾的腦靶向納米器件，其特征在于，由陽離子樹枝狀大分子材料、激活型Caspase？3特異性反應元件、淬滅劑和狂犬病毒糖蛋白衍生的多肽RVG29組成；以多肽RVG29作為腦靶向頭基，陽離子樹狀大分子為載體材料，通過雙功能連接劑連接RVG29構建成腦靶向載體。
【技術特征摘要】
1.一種多肽修飾的腦靶向納米器件，其特征在于，由陽離子樹枝狀大分子材料、激活型Caspase-3特異性反應元件、淬滅劑和狂犬病毒糖蛋白衍生的多肽RVG29組成；以多肽RVG29作為腦靶向頭基，陽離子樹狀大分子為載體材料，通過雙功能連接劑連接RVG29構建成腦祀向載體。2.按權利要求I所述的多肽修飾的腦靶向納米器件，其特征在于，所述的腦靶向載體中，以陽離子樹枝狀大分子材料、Cy5標記的含有DEVD序列的多肽、QSY21和多肽RVG29為組分，Cy5標記的含有DEVD序列的多肽和RVG29通過雙功能連接劑以共價方式連接樹狀大分子載體，QSY21直接共價連接于樹枝狀分子載體。3.按權利要求I或2所述的多肽修飾的腦靶向納米器件，其特征在于，所述的狂犬病毒糖蛋白衍生的多肽RVG29，具有SEQ ID NO. I的序列； 所述的陽離子樹枝狀大分子材料選自聚左旋賴氨酸樹枝狀分子和聚酰胺-胺； 所述的雙功能連接劑為Sulfo-LC-SMPT ； 所述的Cy5標記的含有DEVD序列的多肽其序列為CGDEVDAPK ； 所述的淬滅劑是QSY21。4.按權利要求2所述的多肽修飾的腦靶向納米器件，其特征在于，所述的Cy5標記的含有DEVD序列的多肽與陽尚子樹狀大分子材料的分子比是I 10 : I。5.按權利要求2所述的多肽修飾的腦靶向納米器件，其特征在于，所述的QSY21與Cy...
【專利技術屬性】
技術研發人員：蔣晨，劉洋，
申請(專利權)人：復旦大學，
類型：發明
國別省市：
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