DCX和SPARC雙基因共表達載體在制備放療增敏劑中的應用制造技術

本發明專利技術公開了DCX和SPARC雙基因共表達載體在制備放療增敏劑中的應用。通過構建DCX和SPARC雙基因共表達重組腺病毒載體能夠有效提高膠質瘤的放療敏感性。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及ー種基因藥物，尤其涉及DCX和SPARC雙基因共表達載體在制備放療增敏劑中的應 用。
技術介紹
膠質瘤是發生于神經外胚層的腫瘤，故亦稱神經外胚層腫瘤或神經上皮腫瘤。腦膠質瘤的基本治療手段是手術切除+放療和化療。隨著分子生物學、免疫生物學、腫瘤免疫學和醫學生物工程的發展，腦膠質瘤治療的新方法新技術不斷出現，如細胞免疫治療、分子靶向治療、熱療等。在這些治療方法中，各種都有自身的局限性。腦膠質瘤因其惡性程度對放射治療不甚敏感，一般認為分化差的腫瘤較分化好的為高。放療的臨床效果也不是很令人滿意，一是受到放射劑量的限制，再者就是大多數腦膠質瘤細胞對射線具有抗性，加大照射劑量又會増加對周圍正常腦組織的輻射損傷。隨著基因技術的不斷深入研究，如何能利用基因有效治療膠質瘤已成為當今研究的熱點?；蛑委煹姆肿硬呗灾饕毎芷谡{節、自殺基因療法、免疫基因療法、抑癌基因治療、抗血管生成治療、以及生長因子等。而且于同一載體上同時表達多個外源基因在生物學領域中具有廣泛的應用價值，尤其在針對腫瘤等疾病發生發展的各個環節設計多基因共表達載體的聯合基因治療更備受關注。因而構建合適的載體獲得多個外源基因的高效轉移與表達具有重要意義。雙基因或多基因的構建現主要采取兩種途徑一是將多個攜帶不同治療基因的獨立載體系統同時轉染靶細胞表達多個基因[20]，優點是可以自由調節各表達載體的比例，但是效率太低，載體的副作用明顯；ニ是在同一載體上實現多基因共表達，其實現多個基因共同表達的方式主要有在多個基因之間插入獨立啟動子表達盒、內部核糖體結合位(LRES)或連接2A序列、Furin切割序列等。與多個攜帶不同治療基因的獨立載體實現共表達相比，于同一載體上實現多基因共表達可提高轉移及表達效率。
技術實現思路
本專利技術的專利技術目的是提供ー種DCX和SPARC雙基因共表達載體在制備放療增敏劑中的應用，以解決膠質瘤對放療不敏感的問題。為達到上述專利技術目的，本專利技術采用的技術方案是DCX和SPARC雙基因共表達載體在制備放療增敏劑中的應用。具體地，通過構建DCX和SPARC雙基因共表達重組腺病毒載體，由重組腺病毒對膠質瘤細胞進行感染，增加G2期細胞的比例，以提高膠質瘤細胞的放射敏感性。所述重組腺病毒載體的構建方法是 (I)針對DCX和SPARC基因序列，制備PCR引物，所述PCR引物由 DCX 正義引物 GCAAGATCTATGAAAACACTCCCCCTTC、DCX 反義引物 TAAGGTACCTTACATGGAATCACCAAGCG、SPARC 正義引物 TAAGCGGCCGCATGAGGGCCTGGATCTT 和 SPARC 反義引物 TAGCTCGAGTTAGATCACAAGATCCTTGT 構成，在 DCX 兩端分別引入 BglII 和KpnI酶切位點，SPARC兩端分別引入NotI和XhoI酶切位點，擴增得到DCX和SPARC目的片段； (2)雙酶切目的基因PCR產物和pAdTrack-CMV-polyA-promoter空載體轉移質粒，用T4 DNA連接酶將其4°C連接過夜，構建單、雙基因重組轉移質粒載體pAdTrack-CMV-DCX-polyA+promoter, pAdTrack-CMV-polyA+promoter-SPARC,和 pAdTrack-DCX-poIyA-promo t er-SPARC ； (3)將構建的單、雙基因重組轉移質粒用PmeI單酶切線性化后，與pAdEasy-Ι腺病毒骨架質粒共轉化BJ5183大腸桿菌，用PacI單酶切鑒定并轉化DH5 α大腸桿菌；· (4)將成功重組的 pAd-polyA+promoter、pAd-DCX-polyA+promoter>pAd-poIyA+promoter-SPARC 和 pAd-DCX-polyA+promoter-SPARC 在 DH5 α 大腸桿菌擴增抽提，PacI酶切線性化后用脂質體2000 (Iipofectamine 2000)轉染293Α細胞，所得腺病毒為 Ad-GFP, Ad-DCX, Ad-SPARC, Ad-DCX-SPARC。由于上述技術方案運用，本專利技術與現有技術相比具有下列優點 本專利技術提供了 DCX和SPARC雙基因共表達重組腺病毒載體，獲得的腺病毒Ad-DCX-SPARC具有感染細胞的能力，并且顯著提高了感染細胞中DCX和SPARC的表達水平，能夠有效提高膠質瘤的放射敏感性。附圖說明圖I是本專利技術實施例中的雙基因連接方式示意 圖2是腺病毒構建及包裝示意 圖3是實施例中PCR產物瓊脂糖電泳圖 4 是實施例中 PacI 單酶切鑒定 pAd-po I yA+pr omo ter、pAd-DCX-po I yA+pr omo t er >pAd-poIyA+promoter-SPARC>pAdTrack-DCX-polyA-promoter-SPARC ； 圖5是實施例中RT-PCR鑒定Ad-DCX-SPARC的表達； 圖6是實施例中重組腺病毒體外感染U251細胞熒光表達情況； 圖7是實施例中腺病毒感染后GFP陽性細胞的比例； 圖8是實施例中重組腺病毒對U251生長的影響； 圖9是實施例中重組腺病毒感染后照射對U251生長的影響； 圖10是實施例中重組腺病毒對U251細胞周期的影響； 圖11實施例中重組腺病毒感染后照射對U251細胞凋亡的影響。具體實施例方式下面結合附圖及實施例對本專利技術作進ー步描述 實施例 一.構建DCX和SPARC雙基因共表達重組腺病毒載體 技術流程1、針對DCX和SPARC設計引物(表1)，在DCX兩端分別引入BglII和KpnI酶切位點，SPARC兩端分別引入NotI和XhoI酶切位點。以人cDNA文庫為模板，在Phusion高保真DNA聚合酶的作用下擴增得到DCX和SPARC的目的片段，并進行瓊脂糖電泳鑒定。表I. PCR 引物 細通For GCAAGATCTATGMMCACTCOCCCTTC Dd - 8ct TMGGTAGLTTACATGGAATCACCAAGCG SPARC For TMGCGGODGCATCAGGGOCTGGATOTRct : TAGCrCKA&raCATaOAGATOCTTCT 2、雙酶切目的基因PCR產物和pAdTrack-CMV-polyA-promoter空載體轉移質粒，用T4DNA連接酶將其4°C連接過夜(連接方式見圖I)。連接產物轉化DH5a大腸桿菌，用LB瓊脂平板(含50 μ g/ml卡那霉素)篩選抗性克隆。在DNA序列測定后，將陽性克隆保種備用。構建的單、雙基因重組轉移質粒載體為pAdTrack-CMV-DCX-polyA+promoter,pAdTrack-CMV-poIyA+promoter-SPARC, pAdTrack-DCX-poIyA-promoter-SPARC。3、將構建的單、雙基因重組轉移質粒用PmeI單酶切線性化后，與pAdEasy-Ι腺病毒骨架質粒共轉化BJ5183大腸桿菌，用LB瓊脂平板(含50 μ g/ml卡那霉素)篩選抗性克隆。用PacI單酶切鑒定并轉化DH5a大腸桿菌。4、將成功本文檔來自技高網...

【技術保護點】
DCX和SPARC雙基因共表達載體在制備放療增敏劑中的應用。

【技術特征摘要】
1.DCX和SPARC雙基因共表達載體在制備放療增敏劑中的應用。2.根據權利要求I所述的應用，其特征在于通過構建DCX和SPARC雙基因共表達重組腺病毒載體實現。3.根據權利要求2所述的應用，其特征在于所述重組腺病毒載體的構建方法是 (1)針對DCX和SPARC基因序列，制備PCR引物，所述PCR引物由DCX 正義引物 GCAAGATCTATGAAAACACTCCCCCTTC、DCX 反義引物 TAAGGTACCTTACATGGAATCACCAAGCG、SPARC 正義引物 TAAGCGGCCGCATGAGGGCCTGGATCTT 和 SPARC 反義引物 TAGCTCGAGTTAGATCACAAGATCCTTGT 構成，在 DCX 兩端分別引入 BglII 和KpnI酶切位點，SPARC兩端分別引入NotI和XhoI酶切位點，擴增得到DCX和SPARC目的片段； (2)雙酶切目的基因PCR產物和pAdTrack-CMV-polyA-promoter空...

【專利技術屬性】
技術研發人員：劉芬菊，徐媛媛，蔣昕，俞家華，
申請(專利權)人：蘇州大學，
類型：發明
國別省市：