本發(fā)明專利技術(shù)屬于食品及飲料中芒果源性成分的快速篩查試劑盒與檢測技術(shù)，具體是使用實時熒光PCR技術(shù)檢測芒果的ITS2基因基因片段。本發(fā)明專利技術(shù)針對芒果源性成分采用實時熒光PCR技術(shù)，快速、靈敏、特異地檢測內(nèi)含基因，從而篩選食品及飲料中是否含芒果源性成分。該快速篩查試劑盒及檢測技術(shù)用于檢測混合樣品中可能含有過敏原芒果成分，也可以用于檢測樣品中是否不含有芒果成分。該方法快速、特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡便、重復(fù)性好。
【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)屬于食品及飲料中植物源性成分芒果DNA檢測技術(shù)，具體地說是使用實時熒光PCR反應(yīng)技術(shù)對食品及飲料中芒果進(jìn)行快速篩選與檢測的方法，方法包括DNA的提取、實時熒光PCR擴(kuò)增和結(jié)果判定。其優(yōu)點是快速、特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡便、重復(fù)性好。
技術(shù)介紹
芒果mango,學(xué)名Mangifera indica Linn.,別名檬果、潘果、悶果、蜜望、望果、面果和庵波羅果，屬漆樹科(Anacardiaceae)芒果屬。芒果不僅果肉豐厚甜美，而且有助于美容養(yǎng)顏和減肥，有“熱帶果王”之譽(yù)稱。全世界約有1000多個芒果品種，而且芒果經(jīng)常被加工成芒果汁、食品、雪糕、酸奶、糖等。芒果肉質(zhì)香甜可ロ是深受人們喜愛的熱帶水果。芒果雖然味美營養(yǎng)豐富，但因其性濕熱，多食不但無益反而有害，尤其是有些人對芒果會有敏感癥狀，因此芒果也是常見的水果過敏原之一。近年來因芒果過敏的患者越來越多，出現(xiàn)ロ 瘡，水果疹，口腔麻癢，嚴(yán)重的會出現(xiàn)哮喘和過敏性休克等癥狀。芒果食品加工品在進(jìn)行加エ處理后中，往往失去芒果可鑒別的形態(tài)特征，為芒果食品鑒別帶來不便。隨著芒果制品及飲料不斷擴(kuò)大，不法制造商為節(jié)約成本，采用食品添加原料以次充好，冒充純天然果汁制造水果加工品，擾亂加工市場。為了保護(hù)公眾權(quán)益，建立可靠的芒果的檢測方法迫在眉睫。食品中是否混有芒果源性成分，尚沒有ー個快速的判定方法。大部分消費者需求判斷含有芒果源性成分的方法，少數(shù)消費者由于對芒果過敏需求不含芒果成分的食品加工品。消費者的生活質(zhì)量需要過硬的檢測方法和依據(jù)來保證。
技術(shù)實現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的是針對芒果ITS2基因設(shè)計ー組特異性引物，建立ー種在食品及飲料中快速篩選和檢測芒果源性成分實時熒光PCR檢測方法，以克服基于外部形態(tài)檢測方法在食品加工產(chǎn)品檢測中的局限性，為食品及飲料中芒果產(chǎn)品檢測提供快速檢測的方法。本專利技術(shù)的主要原理為設(shè)計ー組可以特異地識別芒果序列的引物對和探針，完善實驗體系和反應(yīng)條件，通過實時熒光PCR反應(yīng)使靶DNA快速累積到IO9 101°拷貝，經(jīng)過熒光擴(kuò)增曲線、Ct值判別擴(kuò)增結(jié)果。本專利技術(shù)中建立的成熟的實驗方法可保證在食品、飲料等加工制品中檢出芒果源性成分。該方法省略了瓊脂糖電泳等過程，可以直接用熒光PCR觀察擴(kuò)增曲線進(jìn)行判讀，簡單而快速特別適用于ー些檢測ー線的單位。快速檢測芒果源性成分的試劑盒包括PCR擴(kuò)增反應(yīng)液、陽性對照DNA兩種特征性部分；反應(yīng)體系總體積為25 μ L，其中含樣品DNA(10yg/mL-100yg/mL)2yL，芒果引物對(10ymol/L)各 O. 5 μ L，芒果探針(10ymol/L) I μ L，Taq DNA聚合酶(5U/ μ L) 0. 5 μ 1，dNTP (10 μ mol/L) 2 μ L，10 X PCR緩沖液2. 5 μ L,水補(bǔ)足至總體積25 μし也可采用商品化的實時熒光PCR擴(kuò)增體系，反應(yīng)預(yù)混液Real time Mix 10 μ L、10 Ii mol/L上游引物0. 5 u L>10 u mol/L下游引物0. 5 u L>10 u mol/L探針I(yè) u L和模板成分2 U I,加ddH20 (滅菌雙蒸水)補(bǔ)足至25 ii I。本專利技術(shù)涉及的實時熒光PCR擴(kuò)增檢測用的引物和探針，其序列如下(I)上游引物5’ -TCTGAGTTCTCGGTGACGCTTTC-3 ；(2)下游引物5’ -CCGGTCTCTAGGGTCGAAGAGC-3’ ；(3)探針序列5’ -FAM-ATCCTGTCGTGCGGTTGCGITCTCC-TAMRA-3’。在實際應(yīng)用中，上游引物、下游引物和探針的體積比為1 : I : 2。陽性對照DNA為含有芒果源性成分的DNA提取液。 實時熒光PCR檢測食品加工產(chǎn)品中芒果成分的方法，依次包括下列步驟(1)-(3)(I)待檢樣品DNA的提取A.稱取0. Ig樣品，轉(zhuǎn)至I. 5mL離心管中。加入600 U L預(yù)熱的裂解緩沖液，輕輕混勻后，65°C水浴保溫IOmin ；B.在管中加入等體積酚/氯仿600 u L，上下顛倒充分混勻，抽提2min ；C. 12000g離心5min，吸取上清到一新的離心管中，加入與上清等體積的沉淀液，混勻，常溫放置IOmin后，12000g離心5min,去上清,保留沉淀；D.在沉淀中加入60 ii L RNA酶，37°C放置2min后，用槍頭將其充分混勻，于37°C溶解沉淀，5min后加入300 u L緩沖液,上下顛倒混勻10次；E.取出離心柱，將離心柱放置在I個2mL的套管上，將溶液加入到離心柱中，放置2min ；F.將離心柱和2mL套管一起用8000g離心30sec，棄去套管中溶液，在離心柱中加A 200 u L洗液，8000g離心30sec，棄去溶液；重復(fù)此步驟一次；G.在離心柱中加入200ii L70%こ醇，8000g離心30sec，棄去溶液；重復(fù)此步驟ー次；H. 12000g離心30sec，除去離心柱中痕量殘留溶液；I.將離心柱放置在一個新的I. 5mL離心管中，在離心柱底部中央加入50 ii L洗脫緩沖液，37°C放置2min后，12000g離心30sec。離心管中的溶液即可用作PCR反應(yīng)的模板。(2) PCR 擴(kuò)增A.在擴(kuò)增反應(yīng)管中加入 Real time Mix 10 ii L、10 ii mol/L 上游引物 0. 5 ii L、10 V- mol/L下游引物0. 5 ii L、10 ii mol/L探針I(yè) ii L、ddH20(滅菌雙蒸水)補(bǔ)足至25 ii I,混勻；B.在擴(kuò)增反應(yīng)管中加入待檢樣品DNA2 ii L (約200ng)，混勻；C.在熒光PCR儀中進(jìn)行PCR反應(yīng)40-45個循環(huán)，程序為預(yù)變性95°C 3min，40-45 個循環(huán)95°C 15s，60°C 30s。(3)結(jié)果檢測實時熒光PCR反應(yīng)結(jié)束后，儀器自動分析數(shù)據(jù)，得出Ct值和擴(kuò)增曲線。總體看曲線拐點清楚，指數(shù)其明顯，擴(kuò)增曲線整體平行性好，基線無上揚現(xiàn)象，方由Ct值判斷結(jié)果。根據(jù)熒光信號的Ct值進(jìn)行判斷，當(dāng)待測樣品的基因檢測Ct值大于或等于45，陽性對照和空白對照結(jié)果正常，則可判斷為樣品中未檢出芒果基因，樣品中不含有芒果源性成分。當(dāng)待測樣品的結(jié)構(gòu)特異性基因檢測Ct值小于或等于36，陽性對照和空白對照結(jié)果正常，則可判斷為樣品中檢出芒果基因，樣品中含有芒果源性成分。當(dāng)待檢測樣品結(jié)構(gòu)特異性基因檢測Ct值大于36小于45，應(yīng)重做實時熒光PCR檢測，若重做后Ct值仍小于45，陽性對照和空白對照結(jié)果正常，則可判斷為樣品中檢出芒果基因；若重做后Ct值大于45，且陽性對照和空白對照結(jié)果正常，則可判斷為樣品中未檢出芒果基因。附圖說明圖I多個品種芒果的ITS2基因片段實時熒光PCR圖譜。圖2不同稀釋度臺芒DNA溶液的實時熒光PCR擴(kuò)增圖及2種未知濃度芒果果汁飲料擴(kuò)增圖。·具體實施例方式下面結(jié)合實施例對本專利技術(shù)做進(jìn)ー步說明。實施例I按照以下程序進(jìn)行檢測(I)待測可能含芒果成分樣品DNA的提取A.稱取O. Ig樣品，轉(zhuǎn)至I. 5mL離心管中。加入600 μ L預(yù)熱的裂解緩沖液，輕輕混勻后，65°C水浴保溫IOmin ；B.在管中加入等體積酚/氯仿600 μ L，上下顛倒充分混勻，抽提2min ；C. 12000g離心本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點】
快速檢測芒果源性成分的試劑盒包括P？C？R擴(kuò)增反應(yīng)液、陽性對照D？N？A兩種特征性部分：P？C？R擴(kuò)增反應(yīng)液總體積為25μL，其中含：樣品DNA(10μg/mL？100μg/mL)2μL，芒果引物對(10μmol/L)1μL，芒果探針(10μmol/L)1μL，Taq？DNA聚合酶(5U/μL)0.5μl，dNTP(10μmol/L)2μL，10×PCR緩沖液2.5μL，水補(bǔ)足至總體積25μL。也可采用商品化的實時熒光PCR擴(kuò)增體系，反應(yīng)預(yù)混液Real？time？Mix？10μL、10μmol/L上游引物0.5μL、10μmol/L下游引物0.5μL、10μmol/L探針1μL和模板成分2μl，加ddH2O(滅菌雙蒸水)補(bǔ)足至25μl。本專利技術(shù)涉及的實時熒光PCR擴(kuò)增檢測用的引物和探針，其序列如下：(1)上游引物：5’？TCTGAGTTCTCGGTGACGCTTTC？3’；(2)下游引物：5’？CCGGTCTCTAGGGTCGAAGAGC？3’；(3)探針序列：5’？FAM？ATCCTGTCGTGCGGTTGCGTTCTCC？TAMRA？3’。在實際應(yīng)用中，上游引物、下游引物和探針的體積比為：1∶1∶2。陽性對照DNA為含有芒果源性成分的DNA提取液。...
【技術(shù)特征摘要】
1.快速檢測芒果源性成分的試劑盒包括Pc R擴(kuò)增反應(yīng)液、陽性對照D N A兩種特征性部分 P C R擴(kuò)增反應(yīng)液總體積為25iiL，其中含樣品DNA(10iig/mL-100iig/mL)2iiL，芒果引物對(10iimol/L)liiL，芒果探針(10umol/L)luL, Taq DNA 聚合酶(5U/u L) 0. 5 U I,dNTP(10umol/L)2u L, 10 XPCR緩沖液2. 5 y L，水補(bǔ)足至總體積25 yし也可采用商品化的實時熒光PCR擴(kuò)增體系，反應(yīng)預(yù)混液Real time Mix 10 y L、10 y mol/L上游引物0. 5 y L、10 u mol/L下游引物0. 5 u L>10 u mol/L探針I(yè) ii L和模板成分2 ii I,加ddH20(滅菌雙蒸水)補(bǔ)足至25u I0 本發(fā)明涉及的實時熒光PCR擴(kuò)增檢測用的引物和探針，其序列如下 (1)上游引物5’-TCTGAGTTCTCGGTGACGCTTTC-3 ；· (2)下游引物5’-CCGGTCTCTAGGGTCGAAGAGC-3’ ； (3)探針序列5’-FAM-ATCCTGTCGTGCGGTTGCGITCTCC-TAMRA-3’。在實際應(yīng)用中，上游引物、下游...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：劉彩霞，高宏偉，孫敏，龔方，徐彪，梁成珠，
申請(專利權(quán))人：山東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心，
類型：發(fā)明
國別省市：
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