用于鑒定和分離表達多肽的細胞的方法技術

本發明專利技術涉及新型多肽和包含所述多肽的細胞。所述多肽和細胞用于鑒定和/或分離產生具有特定生物功能的蛋白質的細胞的方法中。具體地，所述方法可用于鑒定、選擇和分離產生抗原特異性單克隆抗體的細胞。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】
本專利技術的領域總體上涉及新型多肽和包含所述多肽的細胞。本專利技術還涉及在鑒定和/或分離表達多肽的細胞的方法中使用所述多肽。所述方法可用于鑒定和分離產生抗原特異性單克隆抗體的細胞。
技術介紹
自1970年代單克隆抗體技術發展以來，單克隆抗體已成為日益重要的治療劑種類。雜交瘤技術仍然是用于生成單克隆抗體的最常用方法。單克隆抗體從通過將正常抗體生成B-細胞與永生化骨髓瘤細胞或其它永生化細胞融合產生的雜交瘤細胞分泌。單克隆抗體產生的過程通常包括幾輪篩選上清液以鑒定生成結合目標抗原的抗體的雜交瘤。生成針對目標抗原的單克隆抗體的雜交瘤的鑒定通常通過ELISA篩選來完成。可篩選由來自雜交瘤文庫的隨機雜交瘤克隆的混合物生成的上清液。該方法具有局限性，因為其接著必須通過有限稀釋陽性混合物(positive pool)以分離單個克隆，隨后所有克隆需要進行再篩選。在一些情況下，通過作為生成非常大量單一克隆的第一步驟進行有限稀釋來克隆雜交瘤文庫，以進行篩選。包括有限稀釋步驟的任何方法是有問題的，因為其是極其費時費力的。此外，在一些情況下，期望的克隆可代表雜交瘤文庫的極低百分比，這使得稀少克隆的鑒定十分困難。此外，ELISA篩選法鑒定對單個抗原的結合活性。為了確定單克隆抗體是否結合超過一種抗原，必須利用不同的個別抗原進行多個連續ELISA篩選。如果生成抗體的細胞以允許抗體生成細胞本身被直接鑒定的形式(例如，在細胞的表面上)保留抗體，則這是有利的。該策略是噬菌體展示技術一直如此成功的原因之一。事實上，正常B-細胞產生膜結合免疫球蛋白并且該分子是響應與抗原的結合發出信號的B-細胞受體復合物的核心組分。天然膜結合抗體的存在先前已被用于試圖直接分離雜交瘤(參見，Parks等人1979，PNAS，76:1962-1966)。然而，極低水平的膜結合抗體限制了方法的使用。已開發了幾個其它技術來進一步完成該目標。一個方法是“分泌捕獲報告網(secretion capture report web) ”(SCRW),其將細胞封裝在生物素化的瓊脂糖微滴中，隨后將微滴懸浮物與抗生物素蛋白和生物素化的抗-小鼠IgG繼續溫育。抗生物素蛋白用作生物素化的瓊脂糖與生物素化的抗-小鼠抗體之間的橋梁以在微滴內形成捕獲位點來捕獲由細胞分泌的抗體。可篩選此類含抗體的微滴結合報道分子(例如，熒光標記的抗原)的能力并且可利用流式細胞術分離所述微滴。(參見，Kenney等人，1995, NatureBiotechnology 8:787-90 ;Gray 等人，1995, J. Immunol. Methods 182:155-63)。其它方法基于瞬時捕獲分泌的蛋白質或細胞表面上的抗體的能力。可通過報道分子(例如，熒光標記抗原)的結合檢測細胞表面上的“捕獲的”蛋白質或抗體并且例如通過流式細胞術(參見，例如，美國專利No. 6，919，183和7，166，423 ;美國專利申請No. 2010/0009866)進行分離。此類技術的每一個技術具有局限性。瓊脂糖微滴技術在技術上存在困難并且需要專門的設備來產生瓊脂糖微滴。此外，細胞可能對封裝過程敏感。細胞表面捕獲法不能完全區分由目標雜交瘤細胞生成的抗體與由其它雜交瘤細胞生成的抗體。相鄰細胞之間的目標抗體或蛋白質的擴散可以是個問題。例如，抗體可與與生成其的細胞上的捕獲分子分離并且擴散至生成不同抗體的細胞并且被該細胞“捕獲”。因此，在一些情況下，所述方法需要高度粘稠的培養基來減少蛋白質或抗體從表達細胞的擴散。此外，實際上，并非所有由雜交瘤生成的抗體都被捕獲在細胞表面上，該過量抗體被分泌入培養基中，在培養基中其容易結合其它隨機雜交瘤細胞上的捕獲分子。因此，需要用于鑒定和選擇生成抗原特異性單克隆抗體的細胞的新型和/或改進的方法。專利技術概要本專利技術描述了新型多肽和包含所述多肽的細胞以及使用所述多肽、細胞和細胞文 庫鑒定和/或分離生成所述多肽的細胞的方法。具體地，所述方法可用于鑒定和分離生成抗原特異性單克隆抗體的細胞。本專利技術提供了其中包含單個抗原結合位點的膜結合的異二聚體分子在細胞表面上表達的方法。單個抗原結合位點代表了由細胞生成的抗體的結合特異性。異二聚體分子不“結合”分泌的抗體，因此，對于由一個細胞生成的結合在或存在于另一個細胞的表面上的抗體問題有限或無問題。本文中描述的方法和構建體稱為“膜_MAb”或“膜-MAb技術”和“膜-MAb構建體”。新型多肽構建體包含多肽，所述多肽包含來自免疫球蛋白或非免疫球蛋白的二聚化結構域和跨膜區。在一些實施方案中，新型多肽構建體包含含有CH2和CH3結構域的免疫球蛋白重鏈恒定區和來自免疫球蛋白或非免疫球蛋白的跨膜區。在一些實施方案中，新型多肽構建體包含含有CH2和CH3結構域的免疫球蛋白重鏈恒定區和GPI (糖基磷酯酰肌醇)_膜錨著點。當細胞表達多肽和例如免疫球蛋白重鏈時，多肽締合以生成包含在細胞表面上表達的單價抗體的異二聚體分子。異二聚體分子不是抗體結合蛋白，這樣其不結合或捕獲分泌的抗體。膜-MAb策略的非限定性實例描述于圖IC中。可將這與常規雜交瘤技術(附圖說明圖1A)和表面捕獲法的實例(圖1B)相比較。在一個方面，本專利技術提供了能夠與第二多肽形成異二聚體分子的多肽，其中首先多肽是膜結合的并且異二聚體分子在細胞表面上表達。在一些實施方案中，多肽包含(a)含有二聚化結構域的細胞外部分和(b)跨膜部分。在一些實施方案中，二聚化結構域可包括但不限于Fe區域、免疫球蛋白恒定區、亮氨酸拉鏈或異亮氨酸拉鏈。在一些實施方案中，二聚化結構域可獲自受體、整聯蛋白或通常形成二聚化或多聚化結構的任何分子。二聚化結構域可獲自例如免疫球蛋白、LFA-1、GPIIIb/IIIa)、神經生長因子(NGF)、神經營養因子-3 (NT-3)、白細胞介素-8 (IL-8)、IL-8受體、血管內皮生長因子(VEGF)、腦源性神經營養因子(BDNF)、Fos, Jun, NFkB, Ras, Raf、CD4、Bcl_2、Myc 和 Met。在一些實施方案中，多肽包含(a)含有免疫球蛋白重鏈恒定區的細胞外部分和(b)跨膜部分。在一些實施方案中，多肽包含(a)細胞外部分，其包含含有CH2和CH3結構域的免疫球蛋白重鏈恒定區；和(b)非-免疫球蛋白跨膜部分。在一些實施方案中，免疫球蛋白重鏈恒定區包含鉸鏈區、CH2和CH3結構域的至少一部分。在一些實施方案中，免疫球蛋白重鏈恒定區包含Fe區域。在一些實施方案中，免疫球蛋白重鏈恒定區來自IgG、IgA、IgD、IgE或IgM抗體或其亞型。在某些實施方案中，免疫球蛋白重鏈恒定區來自IgGl或IgG2抗體。在一些實施方案中，免疫球蛋白重鏈恒定區為小鼠免疫球蛋白重鏈恒定區。在一些實施方案中，免疫球蛋白重鏈恒定區為人免疫球蛋白重鏈恒定區。在一些實施方案中，免疫球蛋白重鏈恒定區包含SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8。在一些實施方案中，本專利技術的多肽包含跨膜部分。在一些實施方案中，跨膜部分包含來自免疫球蛋白或非-免疫球蛋白的跨膜結構域的至少一部分。在一些實施方案中，跨膜部分來自人蛋白質。在某些實施方案中，跨膜部分來自小鼠蛋白質。在一些實施本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】2010.02.12 US 61/304,251;2011.01.31 US 61/437,8891.一種多肽,其包含 (a)包含含有CH2和CH3結構域的免疫球蛋白重鏈恒定區的細胞外部分；和 (b)非免疫球蛋白跨膜部分。2.權利要求I所述的多肽，其中所述免疫球蛋白重鏈恒定區還包含至少一部分鉸鏈區。3.權利要求I或2所述的多肽，其中所述免疫球蛋白重鏈恒定區包含Fe區域。4.權利要求1-3中任一項所述的多肽，其中所述免疫球蛋白重鏈恒定區為IgA、IgD、IgE、IgG、IgM或它們的亞型的任ー個。5.權利要求1-4中任一項所述的多肽，其中所述免疫球蛋白重鏈恒定區為IgGl或IgG2。6.權利要求1-5中任一項所述的多肽，其中所述免疫球蛋白重鏈恒定區為人免疫球蛋白重鏈恒定區。7.權利要求1-5中任一項所述的多肽，其中所述免疫球蛋白重鏈恒定區為小鼠免疫球蛋白重鏈恒定區。8.權利要求1-5中任一項所述的多肽，其中所述免疫球蛋白重鏈恒定區包含SEQIDNO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6 或 SEQ ID NO:8。9.權利要求1-8中任一項所述的多肽，其中所述跨膜部分包含至少一部分選自CD4、CD8、I 類 MHC、II 類 MHC、CD19、T-細胞受體 α 鏈和 β 鏈、CD3、ζ 鏈、ICAMl (CD54)、ICAM2、ICAM3、ICAM4、ICAM5、CD28、CD79a、CD79b 和 CD2 的跨膜結構域。10.權利要求1-9中任一項所述的多肽，其中所述跨膜部分包含SEQID NO: 13或SEQID NO:16。11.權利要求ι- ο中任一項所述的多肽，其為膜結合的并且其中所述免疫球蛋白重鏈區域在細胞的表面上表達。12.權利要求1-11中任一項所述的多肽，其不具有抗原結合位點。13.權利要求1-12中任一項所述的多肽，其能夠與第二多肽形成異ニ聚體分子。14.權利要求13所述的多肽，其中所述第二多肽包含含有CH2和CH3結構域的免疫球蛋白重鏈恒定區。15.權利要求13或14所述的多肽，其中所述第二多肽包含免疫球蛋白Fe區域。16.權利要求13-15中任一項所述的多肽，其中所述第二多肽包含隨機化的多肽。17.權利要求13所述的多肽，其中所述第二多肽包含免疫球蛋白重鏈。18.權利要求17所述的多肽，其中所述免疫球蛋白重鏈與免疫球蛋白輕鏈締合。19.權利要求13-18中任一項所述的多肽，其中所述第二多肽包含具有免疫球蛋白重鏈和免疫球蛋白輕鏈的單鏈免疫球蛋白。20.權利要求13-19中任一項所述的多肽，其能夠與第二多肽形成至少ー個ニ硫鍵。21.權利要求1-12中任一項所述的多肽，其能夠與免疫球蛋白重鏈-輕鏈對的重鏈區域形成至少ー個ニ硫鍵以形成異ニ聚體抗體分子。22.權利要求13-21中任一項所述的多肽，其中所述異ニ聚體抗體分子包含ー個抗原結合位點。23.權利要求1-22中任一項所述的多肽，其不結合分泌的抗體。24.一種多肽，其包含與 SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 31 或 SEQ ID NO: 32 具有至少 80%同一性的序列。25.一種多肽，其包括SEQ ID NO: 10,SEQ ID NO: 12,SEQ ID NO:22,SEQ ID NO:23,SEQID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31 或 SEQ ID NO:32。26.一種多肽，其包含與 SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31 或 SEQ ID NO:32 具有至少 80%同一性的序列。27.一種多肽，其包括 SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31 或 SEQ ID NO:32。28.一種多肽，其基本上由 SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31 或 SEQ ID NO:32 組成。29.一種多肽，其包含由 SEQ ID NO:9、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27 或 SEQ ID NO:29 編碼的序列。30.ー種抗體分子，其包含權利要求1-29中任一項所述的多肽。31.權利要求30所述的抗體分子，還包含 (a)免疫球蛋白重鏈；和 (b)免疫球蛋白輕鏈。32.權利要求30或31所述的抗體分子，其中所述多肽與免疫球蛋白重鏈-輕鏈對的Fe區域形成至少ー個ニ硫鍵。33.權利要求30-32中任一項所述的抗體分子，其包含單個抗原結合位點。34.—種多核苷酸,其編碼權利要求1-29中任一項所述的多肽。35.一種分離的多核苷酸，其包含與 SEQ ID NO:9、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO:24, SEQID NO:25, SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:29具有至少80%同一性的序列的多核苷酸。36.一種分離的多核苷酸，其包含序列SEQ ID NO:9、SEQ ID NO: IUSEQ ID NO:24,SEQID NO: 25、SEQ ID NO: 27 或 SEQ ID NO: 29 的多核苷酸。37.ー種載體,其包含權利要求34-36中任一項所述的多核苷酸。38.ー種宿主細胞,其包含權利要求34-37中任一項所述的多核苷酸或載體。39.ー種宿主細胞，其包含權利要求1-33中任一項所述的多肽或抗體分子。40.—種產生宿主細胞的方法,包括用權利要求34-37中任一項所述的多核苷酸或載體轉染細胞。41.權利要求40所述的方法，其中所述轉染的細胞表達所述多肽。42.權利要求40或41所述的方法，其中瞬時轉染所述細胞。43.權利要求40或41所述的方法，其中穩定地轉染所述細胞。44.權利要求40所述的方法，其中將編碼多肽的所述多核苷酸整合入所述細胞的基因組。45.權利要求40、41、43或44中任一項所述的方法，其中穩定地表達編碼所述多肽的所述多核苷酸。46.權利要求40-45中任一項所述的方法，其中在所述細胞的表面上表達所述多肽。47.權利要求40-46中任一項所述的方法，包括檢測多肽在所述細胞表面上的表達。48.權利要求40-47中任一項所述的方法，包括分離在所述細胞的表面上表達所述多肽的細胞。49.權利要求40-48中任一項所述的方法，其中所述細胞為哺乳動物細胞。50.權利要求40-49中任一項所述的方法，其中所述細胞為鼠細胞。51.權利要求40-49中任一項所述的方法，其中所述細胞為人細胞。52.權利要求40-51中任一項所述的方法，其中所述細胞為融合伴侶細胞系。53.權利要求40-48中任一項所述的方法，其中所述細胞選自Sp2/0、Sp2/0_Agl4、YB2/0、K6H6/B5、NS-1、F0、Y3/Ag I. 2. 3、P3X63Ag8. 653、HEK_293、293T 和 CHO。54.—種宿主細胞，其通過權利要求40-53中任一項所述的方法制備。55.—種宿主細胞,其包含權利要求34-37所述的多核苷酸或載體。56.—種宿主細胞,其包含權利要求1-33中任一項所述的多肽或抗體分子。57.—種宿主細胞,其表達權利要求1-33中任一項所述的多肽或抗體分子。58.權利要求54-57中任一項所述的宿主細胞，其還包含至少ー種額外的多肽。59.權利要求58所述的宿主細胞，其中所述至少ー種額外的多肽包含含有CH2和CH3結構域的免疫球蛋白重鏈恒定區。60.權利要求58所述的宿主細胞，其中所述至少ー種額外的多肽包含免疫球蛋白Fe區域。61.權利要求58所述的宿主細胞，其中所述至少ー種額外的多肽包含免疫球蛋白重鏈。62.權利要求58-61中任一項所述的宿主細胞，其中所述至少ー種額外的多肽包含免疫 球蛋白輕鏈。63.權利要求58所述的宿主細胞，其中所述至少ー種額外的多肽包含具有免疫球蛋白重鏈和免疫球蛋白輕鏈的單鏈抗體。64.權利要求58-63中任一項所述的宿主細胞，其中所述至少ー種額外的多肽為抗體。65.權利要求58-64中任一項所述的宿主細胞，其中所述多肽與第二多肽形成至少ー個ニ硫鍵以形成異ニ聚體分子。66.權利要求58-65中任一項所述的宿主細胞，其中所述多肽與免疫球蛋白重鏈-輕鏈對形成至少ー個ニ硫鍵以形成異ニ聚體抗體分子。67.權利要求66所述的宿主細胞，其中所述免疫球蛋白重鏈-輕鏈對形成單個抗原結合位點。68.權利要求65-67中任一項所述的宿主細胞,其中所述異ニ聚體分子在所述細胞的表面上表達并且包含單個抗原結合位點。69.權利要求65-68中任一項所述的宿主細胞,其中所述異ニ聚體分子不結合分泌的抗體。70.一種產生雜交瘤細胞的方法，包括將權利要求54-57中任一項所述的細胞與抗體生成細胞融合。71.權利要求70所述的方法，其中所述融合細胞在所述細胞表面上表達異ニ聚體抗體分子。72.權利要求70或71所述的方法，其中所述抗體生成細胞是抗體生成細胞的群體。73.權利要求70-72中任一項所述的方法，其中所述抗體生成細胞來自免疫動物。74.權利要求70-72中任一項所述的方法，其中所述抗體生成細胞來自初次接觸實驗的動物。75.權利要求70-74中任一項所述的方法，其中所述抗體生成細胞選自B-細胞、漿細胞、雜交瘤、骨髄瘤和重組細胞。76.權利要求70-75中任一項所述的方法，其中所述抗體生成細胞為小鼠細胞，77.權利要求70-75中任一項所述的方法，其中所述抗體生成細胞為人細胞。78.權利要求70-77中任一項所述的方法，其中所述抗體生成細胞包含多種多核苷酸。79.權利要求78所述的方法，其中所述多種多核苷酸編碼多種包含免疫球蛋白重鏈的多肽。80.權利要求78或79所述的方法，其中所述多種多核苷酸編碼多種包含免疫球蛋白輕鏈的多肽。81.權利要求78或79所述的方法，其中所述多種多核苷酸編碼多種包含具有免疫球蛋白重鏈和免疫球蛋白輕鏈的單鏈抗體分子的多肽。82.權利要求78-81中任一項所述的方法，其中所述多種多核苷酸包含DNA文庫。83.權利要求82所述的方法，其中所述DNA文庫產生自免疫動物的細胞。84.權利要求82所述的方法，其中所述DNA文庫為天然文庫。85.權利要求82-84中任一項所述的方法，其中所述DNA文庫為cDNA文庫。86.權利要求70-85中任一項所述的方法，其中所述融合細胞包含表達多種異ニ聚體抗體分子的雜交瘤細胞的群體。87.—種雜交瘤或雜交瘤文庫,其通過權利要求70-86所述的方法的任一方法制備。88.—種產生細胞文庫的方法，包括用編碼多種多肽的多種多核苷酸轉染權利要求54-57中任一項所述的細胞。89.權利要求88所述的方法，其中所述轉染的細胞表達異ニ聚體分子。90.權利要求89所述的方法，其中所述異ニ聚體分子在所述轉染的細胞的表面上表達。91.權利要求88-90中任一項所述的方法，其中所述多種多核苷酸編碼多種包含含有CH2和CH3結構域的免疫球蛋白重鏈恒定區的多肽。92.權利要求88-90中任一項所述的方法，其中所述多種多核苷酸編碼多種包含免疫球蛋白Fe區域的多肽。93.權利要求88-90中任一項所述的方法，其中所述多種多核苷酸編碼多種包含免疫球蛋白重鏈的多肽。94.權利要求88-93中任一項所述的方法，其中所述多種多核苷酸編碼多種包含免疫球蛋白輕鏈的多肽。95.權利要求88-90中任一項所述的方法，其中所述多種多核苷酸編碼多種包含具有免疫球蛋白重鏈和免疫球蛋白輕鏈的單鏈抗體分子的多肽。96.權利要求88-90中任一項所述的方法，其中所述多種多核苷酸編碼多種多肽，其中每ー種多肽包含(a)免疫球蛋白Fe區域和(b)隨機化的多肽。97.權利要求88-96中任一項所述的方法，其中所述多種多核苷酸包含DNA文庫。98.權利要求97所述的方法，其中從免疫動物的細胞產生所述DNA文庫。99.權利要求97所述的方法，其中所述DNA文庫是天然文庫。100.權利要求97-99中任一項所述的方法，其中所述DNA文庫為cDNA文庫。101.權利要求97所述的方法，其中所述DNA文庫編碼隨機多肽文庫。102.ー種細胞文庫，其通過權利要求88-101所述的方法的任一方法制備。103.一種鑒定生成特異性抗體的細胞的方法，包括將權利要求54-57中任一項所述的細胞與抗體生成細胞融合以產生雜交瘤細胞的群體。104.權利要求103所述的方法，其中所述雜交瘤細胞在所述細胞表面上表達異ニ聚體抗體分子。105.權利要求103或104所述的方法，包括將雜交瘤細胞的群體與檢測分子接觸...

【專利技術屬性】
技術研發人員：奧斯丁·L·格尼，A·L·L·拉茲提克，C·J·邦德，
申請(專利權)人：昂考梅德藥品有限公司，
類型：
國別省市：