診斷細粒棘球蚴病的重組抗原蛋白、其制備方法和用途技術

本發明專利技術公開了一種診斷細粒棘球蚴病的重組抗原蛋白（其氨基酸序列如SEQ?ID?NO:1所示）。此外，本發明專利技術還公開了上述重組抗原蛋白的制備方法，包括采用RT-PCR擴增EgENO基因，將其克隆到表達載體PET28a(+)中構建重組質粒PET28a-EgENO，轉化到大腸桿菌BL21(DE3)中，經IPTG誘導表達重組蛋白，用SDS-PAGE及Western?blotting對純化后重組抗原進行鑒定。此外，本發明專利技術還公開了上述重組抗原蛋白的診斷用途。實驗證明，本發明專利技術的重組抗原蛋白對細粒棘球蚴病的診斷具有敏感性和特異性高等優點，在細粒棘球蚴病診斷方面具有廣泛的應用前景。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于生物檢測領域，具體涉及一種重組蛋白，尤其涉及一種診斷細粒棘球蝴病的重組抗原蛋白；此外，本專利技術還涉及上述重組抗原蛋白的制備方法和用途。
技術介紹
細粒棘球蝴病又稱囊型包蟲病(cystic echinococcosis, CE)是一種由細粒棘球絳蟲的幼蟲引起的嚴重危害人體健康和畜牧業發展的人獸共患寄生蟲病，且已成為世界范圍的一個重要的公共衛生、經濟問題。我國是囊型包蟲病發病最高的國家之一，其中以西部的新疆、青海、甘肅、寧夏、西川北部等地最為嚴重，流行區面積占全國總面積的44%以上，嚴重影響西部農牧民身體健康，是西部農牧區因病致貧、因病返貧的重要原因之一。目前CE確診主要是通過物理影像，如X線、B超、斷層掃描及核磁共振等方法，但由于細粒棘球蝴病患者早期無明顯臨床癥狀，這些方法也僅適用確診中、晚期病患階段，所以早期診斷對該病 治療和預后起著重要的作用。對臨床早期可疑病患或對高風險人群進行大規模篩查采用免疫學檢測顯得尤為必要。目前廣泛用于細粒棘球蝴病診斷抗原主要是囊液抗原及其組分抗原B和抗原5等，但受到不易標準化，特異性、敏感性不理想以及與其他帶絳蟲抗原存在交叉反應等問題的限制。尋找具有更高敏感性和特異性的抗原組分，提高對CE的診斷效率，是當前細粒棘球蝴病免疫診斷研究任務中的重要內容之一，而研制特異性快速診斷試劑盒也是目前免疫診斷的發展趨勢。隨著分子生物學技術的發展，用基因工程技術制備重組抗原有助于解決上述問題。根據不完全統計，我國受細粒棘球蝴病威脅的人口在5000萬人以上，但目前對于細粒棘球蝴病(囊型包蟲病)的治療效果尚不理想，所以早期診斷對于人囊型包蟲病(CE)的及時治療至關重要，而具有特異的免疫學診斷對CE的確診有其重要作用。Enolase是利用免疫蛋白質組學技術用CE病人血清從原頭節蟲體蛋白中篩選出的一個抗原性蛋白分子，分子量約為50kDa，其編碼基因為EgENO (細粒棘球絳蟲烯醇酶)，生物信息學分析顯示EgENO含有多個B細胞抗原表位,并且蛋白質組分析顯示Enolase也存在于原頭節排泄分泌物中，提示該分子具有潛在診斷抗原價值。尋找具有更高敏感性和特異性的CE診斷抗原，提高對囊型包蟲病的檢測效率，是當前細粒棘球蝴病免疫診斷研究課題之一。
技術實現思路
本專利技術要解決的技術問題之一是提供一種診斷細粒棘球蝴病的重組抗原蛋白。本專利技術要解決的技術問題之二是提供一種用于診斷細粒棘球蝴病的引物。本專利技術要解決的技術問題之三是提供一種上述診斷細粒棘球蝴病的重組抗原蛋白的制備方法。本專利技術要解決的技術問題之四是提供上述診斷細粒棘球蝴病的重組抗原蛋白的用途。為了解決上述技術問題，本專利技術從我國青海省細粒棘球蝴分離原頭節cDNA擴增了 ENO基因，克隆表達EgENO重組蛋白，通過ELISA方法評價分析重組抗原的診斷價值。在本專利技術的一方面，提供一種診斷細粒棘球蝴病的重組抗原蛋白，其氨基酸序列如SEQ IDN0:1所示。編碼上述重組抗原蛋白的基因為SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。本專利技術提供一種重組質粒載體，其由上述編碼重組抗原蛋白的基因與表達載體PET28a(+)連接構建。所述的連接可以采用本領域常規或已知的方法進行，例如所述的連接可以是將兩側帶有限制性內切酶識別位點的細粒棘球蝴抗原蛋白基因與經相同酶切處理的表達載體PET28a(+)連接，構建重組表達質粒。所述的內切酶可以是本領域通常使用的內切酶，例如EcoR I、Xho I。所述細粒棘球蝴抗原蛋白基因的PCR產物可以通過抽取細粒棘球蝴總RNA，反轉錄成cDNA作為擴增模板，通過PCR法進行擴增而得。本專利技術提供一種轉化體，其由上述重組質粒載體轉化大腸桿菌BL21 (DE3)而得?！ぁに龅霓D化可以按照本領域的常規或已知的方法進行。在本專利技術的另一方面，提供一種用于診斷細粒棘球蝴病的引物，其序列為h游:5’ -GTAGAATTCATGTCCATCTTAAAGATCC-3’ (如 SEQ ID NO:3 所示)或其互補鏈；下游5’-ATACTCGAGTTACAAAGGATTGCGGAAG-3’ (如 SEQ ID N0:4 所示)或其互補鏈。在本專利技術的另一方面，提供一種上述診斷細粒棘球蝴病的重組抗原蛋白的制備方法，包括如下步驟I) EgENO基因擴增，EgENO基因擴增的具體序列如SEQ ID NO: 2所示；2)重組質粒構建和鑒定，采用的重組質粒載體為PET28a(+)；3)重組蛋白的誘導表達及純化。步驟I)具體為設計SEQ ID N0:3和SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列或其互補鏈為引物，抽取細粒棘球蝴總RNA，反轉錄成cDNA，并以其為模板進行RT-PCR擴增。所述RT-PCR擴增的反應條件為94°C預變性5min ;94°C變性lmin，55°C退火30s，72°C延伸lmin，30個循環；最后72°C延伸lOmin。步驟2)具體為將步驟I)所得的PCR產物與經EcoRI和XhoI雙酶切后的表達載體PET28a(+)連接，轉入大腸桿菌DH5a，并培養過夜；篩選陽性菌落提取質粒，雙酶切鑒定并測序，將測序無誤的重組表達質粒轉化到大腸桿菌BL21 (DE3)。步驟3)具體為將重組菌接種于含卡那霉素的LB液體培養基中培養，加入IPTG誘導表達，分別收集誘導前及不同誘導時間菌液，進行SDS-PAGE電泳分析；離心收集菌體，用純化緩沖液重懸，冰浴，后冰上超聲裂解，離心后分別取上清和沉淀進行可溶性分析；按純化試劑盒純化重組蛋白，測定吸光度計算蛋白濃度并用SDS-PAGE鑒定其純度。在本專利技術的另一方面，提供一種上述重組抗原蛋白在制備診斷細粒棘球蝴病藥物中的應用。在本專利技術的另一方面，提供一種上述重組抗原蛋白在制備細粒棘球蝴病診斷試劑盒中的應用。本專利技術從我國青海省細粒棘球蝴包囊中分離原頭蝴，抽提總RNA，采用RT-PCR擴增EgENO基因，將其克隆到原核表達載體PET28a(+)連接構建重組質粒PET28a_EgEN0，轉化到大腸桿菌BL21(DE3)中，經IPTG誘導表達重組蛋白，用SDS-PAGE及Western blotting對純化后重組抗原進行鑒定分析，對32例囊型包蟲病、24例泡型包蟲病、5例日本血吸蟲病、5例弓形蟲病、5例華支睪吸蟲病、4例囊尾蝴病、2例肺并殖吸蟲病和16名健康人共93份血清進行ELISA檢測，評價重組抗原的免疫診斷效果。雙酶切鑒定及測序結果均顯示重組質粒PET28a_EgEN0構建成功，SDS -PAGE及Western blotting分析顯示重組質粒在大腸桿菌BL2KDE3)中獲得高效表達，重組蛋白相對分子質量約為50000，可被囊型包蟲病患者混合血清識別；該重組抗原對CE血清的診斷敏感性為81. 25%，特異性為100% (除泡型包蟲病人血清)。實驗證明，本專利技術的EgENO重組抗原對細粒棘球蝴病的診斷具有敏感性和特異性高等優點，具有較好的診斷價值，為研制相關診斷試劑盒奠定了基礎，在細粒棘球蝴病診斷方面具有廣泛的應用前景。附圖說明圖I是本專利技術實施例中EgENO基因的RT-PCR擴增結果示意圖，其中，M表示DNA標志物，I表示EgENO PCR擴增產物；圖2是本專利技術實施例中重組質粒酶切鑒定結果示意圖，其中，M表示DNA標志物，I本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種診斷細粒棘球蚴病的重組抗原蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ？ID？NO:1所示。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：曹建平，王瑩，沈玉娟，袁忠英，周何軍，徐馀信，張璟，王燕娟，伍衛平，
申請(專利權)人：中國疾病預防控制中心寄生蟲病預防控制所，
類型：發明
國別省市：