一種重組人apoE擬肽及制備方法和應用技術

本發明專利技術公開了一種重組人apoE擬肽及制備方法和應用，一種分離的重組apoE擬肽（EpK），其序列為SEQ?ID?NO：1所示的氨基酸序列。采用原核表達體系表達并經兩步親和層析制備純化的EpK，其優點是產率高、成本低、純化流程簡單、獲得無任何標簽的高純蛋白，并且規模化表達和純化，更易獲得高量純品肽。EpK的功能特征在于具有α螺旋結構，無論體內外均能與脂質結合，并優先與HDL結合。EpK及與其結合的HDL顯著增強了介導巨噬細胞膽固醇外流及抑制巨噬細胞炎癥反應的功能，同時，EpK還可增強巨噬細胞抗氧化的活性。一種重組人apoE擬肽在治療或預防動脈粥樣硬化所致冠心病、心肌梗塞、中風等心腦血管疾病藥物中的應用。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及生物技術藥物及應用領域，具體涉及一種重組的人載脂蛋白E(apoE)模擬活性肽，同時涉及一種載脂蛋白E(apoE)擬肽的制備方法，還涉及一種載脂蛋白E(apoE)擬肽在治療和/或預防動脈粥樣硬化及其所致冠心病、心肌梗塞、中風等心腦血管相關疾病藥物中的應用。
技術介紹
動脈粥樣硬化是多種復雜的病因(氧化應激、炎癥、血脂紊亂、高糖等)誘發下的血管壁功能失調，其特征是動脈壁內膜下脂質聚積及炎性細胞浸潤，包括巨噬細胞泡沫化、平滑肌細胞增殖、細胞外基質的大量積聚，最后形成動脈粥樣硬化斑塊，導致血管管腔變 窄，彈性減少，影響動脈血流，嚴重時完全堵塞血管或斑塊破裂、并發血栓栓塞，從而導致血流灌注的組織器官局部缺血，其并發癥或嚴重后果包括冠狀動脈粥樣硬化引發心肌缺血造成心絞痛、心肌梗塞，腦動脈和頸動脈粥樣硬化引發中樞神經系統缺血造成中風，外周循環或內臟循環的動脈粥樣硬化導致的器官損傷(如腎動脈狹窄造成繼發性高血壓)。動脈粥樣硬化和動脈硬化在定義內涵上有不同的病理特征，本專利技術中所指的動脈粥樣硬化是由于動脈粥樣斑塊使動脈硬化或失去彈性，動脈硬化是指任何一個或多個原因造成的動脈硬化或失去彈性。動脈粥樣硬化的發生發展與機體血脂代謝紊亂、氧化應激損傷及炎癥狀態密切相關。動脈粥樣硬化發生的基本病理過程主要為早期在氧化應激及炎癥因素的刺激下，內皮功能受損，內皮細胞激活分泌黏附分子，使循環中單核細胞向受損內膜下滲入、遷移，演變成巨噬細胞后，通過細胞因子的釋放、與其他細胞的相互作用參與動脈粥樣硬化的進程，同時巨噬細胞自身攝取大量氧化低密度脂蛋白(LDL)轉變為泡沫細胞而成為斑塊中心，故巨噬細胞在動脈粥樣硬化斑塊發生發展全過程中扮演著多方面的重要角色。目前臨床上治療和/或預防動脈粥樣硬化的推薦方案包括藥物防治和手術治療。藥物常以降脂/膽固醇為目的，具體的廣泛采用的是降低LDL-膽固醇(LDL-C)的藥物，包括他汀類(statins)，HMGCoA還原酶抑制劑，消膽胺等降低膽固醇吸收的藥物，以及丙丁酚等。其次常采用的阿司匹林用于抑制血栓形成，抗氧化抗炎作用的藥物也被人們廣泛接受應用。手術治療主要適用于動脈粥樣硬化已產生嚴重并發癥或后果的情況，如球囊成形術、內膜切除術、內置支架、血管搭橋術等介入治療手術。當然，由于動脈粥樣硬化所致的嚴重并發癥和后果，最好還是治療或控制危險因素，如保證合理低脂、低膽固醇、清淡飲食，積極治療和控制高膽固醇血癥、高甘油三酯血癥、糖尿病、高血壓等相關疾病、注意經常鍛煉、降低體重、改善心功能，增強心血管保護因素等。已證實高密度脂蛋白(HDL)是動脈粥樣硬化發生發展的重要負相關因素，HDL具有抗動脈粥樣硬化的作用涉及多種機制，包括促進膽固醇逆向轉運、抗炎、抗氧化、抗血栓形成、促進一氧化氮產生、以及保護內皮功能等。由于針對LDL-C的降脂治療仍存在心血管疾病發生的危險性，且急、慢性炎癥狀態下，HDL功能的異常較HDL-膽固醇(HDL-C)濃度的改變更為突出，因此針對HDL功能的治療成為代謝性疾病和炎癥狀態下抑制動脈粥樣硬化形成的重要途徑。在HDL眾多優點中，介導膽固醇逆向轉運和抗炎兩個功能尤為重要，而且可能存在本質上相互聯系。近年的研究表明HDL對巨噬細胞的抗炎作用可能部分是通過ABCAl和ABCGl介導的膽固醇外流實現的。目前增強HDL功能的藥物和HDL類似物的研發在動脈粥樣硬化治療上顯示了巨大的應用前景。有研究證實他汀類藥物治療就能糾正HDL的功能障礙，恢復其抗炎作用；傳統治療中的貝特類藥物也能有效改善代謝性疾病中HDL顆粒的功能；目前已上市的或正在研發中的一系列HDL增強劑還包括尼克酸(niacin)、膽固醇酯轉運蛋白(CETP)抑制劑、卵磷脂膽固醇酰基轉移酶(LCAT)激活劑、載脂蛋白Al (apoAI)表達刺激物、內皮脂肪酶抑制劑、PPAR/LXR激動劑以及HDL載脂蛋白或其類似物。其中尼克酸因其明顯的升高HDL作用而成為最常規的一種，然而，其引起面色潮紅的不良反應顯然限制了它的使用，并且其抗動脈粥樣硬化和減少心血管疾病發生的效果還待考證。其他的治療劑也都在不同的改進階段。 HDL是一種脂質和蛋白含量大致均等的異質性脂蛋白，組成包括多種載脂蛋白、甘油三酯、磷脂、膽固醇及其酯，其中載脂蛋白包括apo Al (占65-70%)，apO AU (20-25%),apo AIV, apo AV, apo C, apo D, apo E, apo J,等。目前已證實HDL主要有益作用可歸因于它主要的載脂蛋白apoAI和apoE，這促使研究者開發apoAI、apoE或者它們的擬肽以增強HDL的功能。利用人全長apoAI或其突變體apoAI-milano,無脂或與磷脂重構的HDL,還有短的apoAI模擬肽開發增強HDL功能和抗動脈粥樣硬化的藥物，都聚集了人們巨大的興趣，部分研發已在臨床試驗中取得可喜效果。ApoE是HDL另一種主要的載脂蛋白，同時apoE也是其他脂蛋白包括極低密度脂蛋白(VLDL)和乳糜微粒的成分，在脂蛋白代謝和動脈粥樣硬化的致病機制中發揮關鍵作用而使apoE成為一種多功能蛋白，其主要作用是介導循環中膽固醇的清除和血管壁巨噬細胞膽固醇的外流。它是apoE受體、LDL受體(LDLR)和硫酸乙酰肝素糖蛋白(HSPG)的配體，介導攝取脂蛋白殘粒促成肝臟對血漿膽固醇的清除。ApoE還通過其受體介導途徑下調血管壁巨噬細胞活化，進一步抑制與動脈粥樣硬化形成有關的級聯反應(細胞泡沫化、平滑肌細胞增殖等)。無論是游離的蛋白還是HDL顆粒的組分，apoE可促進膽固醇逆向轉運、抗氧化、抗炎、抗平滑肌細胞增殖和激活HDL中LCAT活性等，從而實現HDL的部分功能，降低或減輕了動脈粥樣斑塊的形成，達到抗動脈粥樣硬化的效果。人血漿中apoE濃度平均為5mg/dL。apoE主要由肝臟產生，也有極少量可由血管壁局部的巨噬細胞分泌，在動物研究中發現由血管壁巨噬細胞分泌的apoE可顯著降低動脈粥樣硬化的形成和發展，即使低apoE濃度改變不了血漿中高膽固醇水平。例如，apoE基因缺陷型(apoE+)小鼠被認為是高膽固醇血癥和動脈粥樣硬化的典型動物模型，早在1995年，Linton和Fazio等就報道了利用骨髓移植技術使apoE+小鼠獲得野生型小鼠能分泌apoE的巨噬細胞，其結果可顯著降低apoE+小鼠動脈粥樣硬化斑塊的形成；而野生型小鼠的巨噬細胞如更換為apoE+鼠的巨噬細胞，則加速動脈粥樣硬化改變，即使不影響肝臟合成主要的apoE。申請者也曾證實，補償性給予巨卩遼細胞源性的apoE,可有效改善apoE和SRBI雙基因敲除鼠的高脂血癥并緩解動脈粥樣硬化病程，避免其早發性心衰及幼年夭折。另外apoE在體內具有再循環功能，apoE以乳糜微粒的形式被肝細胞吞噬，隨后一直分離，游離的apoE在胞內與新合成的apoAI結合后，胞吐進入血循環系統成為HDL的重要組分，隨著HDL的成熟，apoE從HDL中脫落再次與乳糜微粒結合而循環,該機制為apoE的革巴向性治療提供非常有益的生物特性，可延長生物半衰期，增加載脂蛋白的功能，這使得人們相信apoE是一類有前景的體內HDL功能增強劑，有望成為一種理想的防治動脈粥樣硬化的藥物。研究顯示本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種分離的重組人apoE擬肽（EpK），其序列為SEQ？ID？NO：1所示的氨基酸序列。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：喻紅，樊大平，杜芬，商亮，吳堯，潘陽，曹佳，李小明，
申請(專利權)人：武漢大學，
類型：發明
國別省市：