減毒的革蘭氏陰性細菌制造技術

本發明專利技術公開并要求保護革蘭氏陰性細菌的突變體，其中所述細菌在核苷酸序列中具有至少一處突變，且由所述核苷酸序列編碼的多肽與由選自下組的核苷酸序列編碼的氨基酸序列具有等于或大于70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％的同一性：SEQID?NO：2、6、9、12、16、19、22、25、28、31、34、37、40、43、46、49、52、55、58、61、64、67、70、75、78、81、84、87、90、和93所示核苷酸序列，所述突變導致細菌的毒力減弱。本發明專利技術還公開并要求保護包含這種突變體的免疫原性組合物和疫苗。（*該技術在2023年保護過期，可自由使用*）

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及活的減毒革蘭氏陰性細菌。減毒的革蘭氏陰性細菌可用于免疫原性組合物或疫苗組合物中，如用于預防細菌感染，以及用于研究，因為減毒菌株為研究人員和可能的接觸者(如動物、人)提供了較高的安全性。因此，本專利技術涉及包含本專利技術革蘭氏陰性細菌如活的減毒革蘭氏陰性細菌的免疫原性或疫苗組合物。組合物中的細菌也可以是滅活的；但是活的減毒革蘭氏陰性細菌可能是有利的。因此，本專利技術還涉及用于制備和/或配制這些組合物的方法；如在合適的培養基上/中培養或培育或繁殖細菌，收獲細菌，任選滅活細菌，并與合適的獸醫學或制藥學可接受載體、賦形劑、稀釋劑、或介質(vehicle)和/或佐劑和/或穩定劑混合；或者，將細菌與合適的獸醫學或制藥學可接受載體、賦形劑、稀釋劑、或介質和/或佐劑和/或穩定劑混合。由此，本專利技術還涉及細菌在配制這些組合物中的用途。減毒細菌還可作為表達或復制載體，如用于對減毒細菌而言異源的核酸分子的復制和/或表達，所述核酸分子如編碼病原體的免疫原、抗原、或表位的核酸分子，病原體的例子是減毒細菌以外的病原體。減毒細菌作為載體的用途也為操作減毒細菌的研究人員或技術人員和可能的接觸者(如動物、人)提供了較高的安全性。因此，本專利技術還涉及用于制備這些載體的方法，如轉化細菌使得細菌包含且任選表達異源核酸分子。本專利技術還涉及這些載體的用途；如用于生成對細菌而言異源的基因產物，如多肽，諸如免疫原、表位、或抗原的方法，包括培養、培育、或繁殖經轉化而包含并在適于表達的條件下表達編碼該基因產物的異源核酸分子的細菌，且任選收獲或分離或分開基因產物；或者，由經轉化而表達它的細菌收獲或分離或分開基因產物；或者，用于引發針對基因產物和/或細菌的免疫學應答或免疫原性應答或者針對衍生或獲得基因產物的病原體和/或該細菌的保護性免疫應答的方法，包括對受試者施用經轉化而表達基因產物的細菌，所述受試者如動物，諸如易受病原體和/或細菌感染的動物，例如?；蚧痣u；或者，用于制備免疫原性、免疫學、或疫苗組合物的方法，包括將載體或經轉化細菌與制藥學或獸醫學可接受載體、稀釋劑、介質、或賦形劑和/或佐劑和/或穩定劑混合。本專利技術還涉及用于細菌減毒的靶標，如編碼細菌減毒靶標的突變型核苷酸序列或基因，以及用于確立細菌減毒靶標多肽的方法和生成減毒細菌的方法。減毒的靶標可以用作免疫原性化合物，如用在免疫原性組合物或疫苗組合物中，或者用于生成免疫原性或疫苗組合物中所使用的表位。由此，本專利技術涉及減毒靶標在制備組合物中的用途，如與制藥學或獸醫學可接受載體、稀釋劑、賦形劑、或介質和/或佐劑和/或穩定劑混合。本專利技術還涉及用于在受試者，如動物，諸如易受革蘭氏陰性細菌諸如巴斯德氏菌感染的動物，如火雞或牛中誘發免疫學或免疫原性或保護性免疫應答的方法，包括對動物施用本專利技術的疫苗或免疫原性組合物。本專利技術甚至還涉及這些減毒細菌的制備，如革蘭氏陰性細菌，諸如巴斯德氏菌；例如，包括將ー種或多種轉座元件導入細菌，井分離包含在目標物種中不引起死亡的(且因而是減毒的)轉座元件的細菌。任選的是，還可以鑒定細菌中的突變，從而能夠獲得生成減毒細菌的候選方法。本專利技術甚至還涉及用于生成減毒細菌的這些候選方法。因為已經鑒定或表征了突變，所以可以通過除了將ー種或多種轉座元件導入細菌以外的技術將突變導入細菌，諸如 通過同源重組，如導致細菌基因組的一部分發生至少ー個添加(插入)或缺失(還設想了兩個或多個添加和/或缺失)或替代(諸如至少ー個核苷酸被另ー種核苷酸替代)的同源重組。因此，本專利技術涉及用于生成包含已知或先前鑒定的修飾或突變(如本文鑒定的修飾或突變)的減毒細菌的方法，包括將缺失或插入或替代導入細菌基因組，通過重組是有利的，并任選鑒定和/或分離包含修飾或突變的細菌。由此，本專利技術還涉及革蘭氏陰性細菌突變體，其中所述細菌在如下核苷酸序列中具有至少ー個突變，由所述核苷酸序列編碼的多肽與由選自下組的核苷酸序列編碼的氨基酸序列具有等于或大于70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、或99%的同一性=SEQID NO :2、6、9、12、16、19、22、25、28、31、34、37、40、43、46、49、52、55、58、61、64、67、70、75、78、81、84、87、90、和93所示核苷酸序列；所述突變導致細菌的毒カ減弱。而且，本專利技術還涉及本文所述這種細菌的用途、組合物、和方法。
技術介紹
已經公認，活的減毒微生物可以作為高度有效的疫苗；與由不進行復制的免疫原產生的免疫應答相比，由這種疫苗引發的免疫應答常常強度更大且時間更長。對此的ー種解釋是活的減毒菌株在宿主中建立了受限感染并模擬天然感染的早期階段。另外，與殺死的或滅活的制劑不同，活的疫苗能夠誘發由細胞介導的有力應答，這可能與它們在抗原呈遞細胞諸如巨曬細胞中的復制能力有關。在動物和人類中使用活的減毒疫苗已經有很長的歷史，特別是使用化學誘變技木。然而，憑借經驗減毒的疫苗能夠恢復毒力。結合關于細菌發病機理的日益増加的知識，現代分子生物學技術鑒定了涉及微生物在體內生長和存活的數種基因。這為減毒提供了新的靶基因，而且提出了這樣的概念，即可以通過將限定的非恢復突變導入已知涉及毒力的選定基因而將未來的疫苗菌株“合理地”減毒，參閱例如 TO-A-00/61724、TO-A-00/68216、和 EP-A-0889120。盡管已經在實驗室中生成了許多減毒菌株，然而只有少數有資格作為潛在疫苗候選者用于動物。這可能是部分由于需要平衡疫苗的免疫原性與微生物恢復活性和致病性的可能性。顯然，為減毒選擇適當基因(這將生成合適的疫苗候選者)并不簡單，而且難以預測。許多因素可能影響減毒突變體作為疫苗的可接受性，因此需要努力研究以鑒定并選擇合適的減毒基因。只是在體外進行了許多減毒實驗，而且它們的結果不能外推至體內，特別是關于由此生成的突變體對接種動物的殘余致病性。參考Kachlany SC、Planet PJ、Bhattacharjee MK、Kollia E、DeSalle R、Fine DH、Figurski DH, Nonspecific adherence by Actmobacillus actinomycetemcomitansrequires genes widespread in bacteria and archaea(伴放線放線桿菌的非特異粘附需要細菌和古細菌中普遍存在的基因)，J BacteriolJOOO年11月，182 (21) :6169_6176。Fuller TE、Martin S、Teel JF、Alaniz GR、Kennedy MJ、Lowery DE, Identification of ActinobaciIIus pleuropneumoniae virulence genes usingsignature-tagged mutagenesis in a swine infection model (豬感染候型中使用標志-標記誘變對大葉性肺炎放線桿菌毒力基因的鑒定)，Microb Pathog, 2000年7月，29(1) :39-51。Fuller TE、 Kennedy MJ^ Lowery DE, Identifica本文檔來自技高網...

【技術保護點】
革蘭氏陰性細菌突變體，其中所述細菌在核苷酸序列中具有突變，且所述核苷酸序列編碼的多肽與由SEQ？ID？NO：75的核苷酸序列編碼的氨基酸序列具有等于或大于70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％的同一性，所述突變導致細菌的毒力減弱，其中所述突變是在SEQ？ID？NO：75的第1072？1087位核苷酸之間的插入。

【技術特征摘要】
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【專利技術屬性】
技術研發人員：H·R·科魯克，J·E·施，R·G·費爾德曼，S·G·科特布羅澤，FX·里格羅斯，
申請(專利權)人：梅瑞爾有限責任公司，
類型：發明
國別省市：