本發(fā)明專利技術目的在于提供一種試劑盒及其應用；本發(fā)明專利技術的另一個目的還在于提供有效穩(wěn)定的獲得外周血MSC的方法。本發(fā)明專利技術采用GCSF聯(lián)合AMD100成功動員外周血并分離培養(yǎng)出成纖維細胞樣貼壁細胞，通過形態(tài)學、貼壁能力、表面標記和三系分化鑒定分離的細胞為MSC，并與同一動物骨髓來源MSC的生物學特性比較發(fā)現：外周血和骨髓來源的MSC具有相同的形態(tài)學特征和貼壁生長能力、表面標記、抗凋亡和衰老的特性；均具備自我更新和三系分化潛能，但骨髓MSC的增殖潛能和成骨能力強于外周血MSC，而成脂和成軟骨分化能力弱于外周血MSC。再者，PB-MSC用于治療關節(jié)軟骨缺損取得較好的修復效果。因此，動員外周血來源的MSC基本具備骨髓MSC相似的生物學特性，其作為一種可供選擇的MSC來源用于細胞治療和再生醫(yī)學領域具有非常廣闊的臨床應用前景。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及再生醫(yī)學領域，特別涉及具有極大臨床應用前景的外周血來源MSC的動員采集培養(yǎng)、生物學特性及應用。
技術介紹
因損傷、感染等導致的組織器官的修復重建一直是臨床細胞治療和再生醫(yī)學領域的研究重點和難題。雖然異體移植的基礎和臨床研究取得了很大的進展，但是自體移植修復重建自體組織器官一直是治療的金標準。近年來中胚層來源的成體干細胞間充質干細胞(Mesenchymal stem cells, MSCs)因其自我更新、多向分化潛能和免疫調控及不存在倫理道德的爭議成為目前細胞治療和組織工程種子細胞的研究熱點。在適當的誘導條件下，MSC在體內外能分化成骨、軟骨、脂肪細胞、纖維組織和支持造血組織、甚至內胚層和外胚層來源的任一組織，移植后能修復重建骨、軟骨、肌肉、肌腱韌帶、腦、脊髓、肺、心血管、肝、皮膚、胃腸道和造血系統(tǒng)，當其注射到早期囊胚泡時能形成大多數成體細胞類型。傳統(tǒng)的MSC主要來源于骨髓(Bone Marrow，BM)，但是其應用于臨床最大的瓶頸是取材的創(chuàng)傷和并發(fā)癥、非常有限的數目(O. 01% O. 001%)及其體外培養(yǎng)生物學特性的改變和轉化。因此開發(fā)其它來源的MSC非常緊迫。除骨髓外，MSC還廣泛分布于間充質組織(如骨、軟骨、肌肉、肌腱、韌帶、脂肪)、骨膜、滑膜、滑液、皮膚、外周血、心血管、肝、胰腺、神經系統(tǒng)、腎、肺、臍(帶)血、胎盤、羊水、胚胎甚至胎兒組織。近年來動員外周血(Peripheral Blood, PB)來源的MSC因其取材微創(chuàng)甚至無創(chuàng)，可以實現真正的自體移植具有非常廣闊的臨床應用前景。但其進入實驗研究和臨床應用的瓶頸是有效的動員方法、動員后MSCs的有限數量和生物學特性容易發(fā)生改變。在正常生理成年或非動員的情況下外周血中很難分離得到貼壁的MSC，有作者報道即使采用常用動員藥物粒細胞集落刺激因子(Granulocyte Colony Stimulating Factor, GCSF)動員后在外周血中也只能分離極少量的MSC，且在體外分離培養(yǎng)20 25天后就出現衰老，增殖能力非常有限，表現為檢測不到端粒酶的活性且端粒酶顯著變短。研究證據表明在某些病理狀況下從骨髓或其他組織釋放MSC歸巢到損傷組織參與其修復，此時在外周血中可以分離得到MSC。骨髓中含有3種細胞造血干細胞(HSC)、內皮祖細胞(EPC)和MSC，干細胞貯留在骨髓微環(huán)境是因為CXCR4和附近支持細胞釋放的SDF-I的相互作用。目前常用的骨髓動員藥物是GCSF，其作用機制是通過減少受體和配子的表達來破壞SDF-1/CXCR4軸動員HSC釋放進入循環(huán)中。最近的研究表明采用GCSF聯(lián)合CXCR4 (chemokine (C-X-C motif)receptor 4)拮抗劑 AMD3100 (又名 Plerixafor)可以導致HSC10倍甚至更多的釋放。在動員HSC的同時是否能刺激MSC的動員呢？目前的問題是MSC的有效的動員及采集方法，再者獲得的細胞是否具備骨髓MSC同樣的生物學特性及體內修復組織缺損的效果目前仍不清楚。
技術實現思路
本專利技術目的在于提供一種試劑盒及其應用；本專利技術的另一個目的還在于提供有效穩(wěn)定的獲得外周血MSC的方法。本專利技術是通過如下技術方案實現的一種試劑盒每一個試劑盒中G-CSF (O. 6ml: IOOug/支)與CXCR4拮抗劑AMD3100(5mg/支)。所述試劑盒在有效穩(wěn)定的獲得外周血MSC的制劑中的應用。一種有效穩(wěn)定的獲得外周血MSC的方法，包括如下步驟I)、采用G-CSF結合AMD3100聯(lián)合動員骨髓MSC釋放入血連續(xù)5天皮下注射GCSF (50 μ g/kg i. h),第 6 天皮下注射 AMD3100 (5mg/kg i. h), Ih 后無菌條件下米血 IOml注入含300U/ml管中。2)、外周血MSC的分離培養(yǎng)擴增抽取血標本與紅細胞裂解液(O. 154M氯化銨，IOmM碳酸氫鉀，O. ImM乙二胺四乙 酸)按體積比I : 10的比例混合，常溫裂解lOmin，經離心、PBS洗后，以106/ml密度重懸于完全培養(yǎng)基中(0|^，10%胎牛血清，10(^/!111青霉素，100μ g/ml鏈霉素，25ng/ml兩性霉素B，2m M L-谷氨酰胺)，置于37°、5%C02培養(yǎng)箱中。3 4天后去除不貼壁細胞，以后每3-4天換液一次，10 15天后細胞達到80% 90%融合，用0. 25%胰酶/0. IEDTA消化，按I : 3或I : 4傳代，體外培養(yǎng)擴增至P3，得到均一的MSC。另一方面，本專利技術還提供上述動員培養(yǎng)的外周血MSC與同一動物個體來源的骨髓MSC的生物學特性比較。此外本專利技術還提供上述動員培養(yǎng)的外周血MSC用于修復關節(jié)軟骨缺損的實例說明其可應用于組織器官病損修復重建中的用途。附圖說明圖I :外周血和骨髓來源MSC的形態(tài)學觀察(相差倒置顯微鏡)圖2 :流式細胞儀鑒定外周血和骨髓來源MSC表面標記圖3 :外周血和骨髓來源MSC的三系分化潛能比較(成骨、成脂、成軟骨)圖4 :外周血和骨髓來源MSC的增殖潛能比較圖5 :外周血和骨髓來源MSC抗凋亡能力比較圖6 :外周血和骨髓來源MSC體外培養(yǎng)細胞衰老比較圖7 =PB-MSC體內修復兔關節(jié)軟骨缺損的效果比較本專利技術采用GCSF聯(lián)合AMD100成功動員外周血并分離培養(yǎng)出成纖維細胞樣貼壁細胞，通過形態(tài)學、貼壁能力、表面標記和三系分化鑒定分離的細胞為MSC，并與同一動物骨髓來源MSC的生物學特性比較發(fā)現外周血和骨髓來源的MSC具有相同的形態(tài)學特征和貼壁生長能力、表面標記、抗凋亡和衰老的特性；均具備自我更新和三系分化潛能，但骨髓MSC的增殖潛能和成骨能力強于外周血MSC，而成脂和成軟骨分化能力弱于外周血MSC。再者，PB-MSC用于治療關節(jié)軟骨缺損取得較好的修復效果。因此，動員外周血來源的MSC基本具備骨髓MSC相似的生物學特性，其作為一種可供選擇的MSC來源用于細胞治療和再生醫(yī)學領域具有非常廣闊的臨床應用前景。實驗例I :兔外周血MSC的動員、分離培養(yǎng)及與骨髓MSC的體外生物學特性比較實驗動物3月齡新西蘭兔，體重± 2kg，雌雄不限。連續(xù)5 天皮下注射 GCSF (50 μ g/kg i. h),第 6 天皮下注射 AMD3100 (5mg/kg i. h),Ih后無菌條件下經耳中央動脈采血IOml注入含300U/ml管中。外周血、骨髓MSC的分離、培養(yǎng)擴增抽取的血標本與紅細胞裂解液(O. 154M氯化銨，IOmM碳酸氫鉀，O. ImM乙二胺四乙酸)按I : 10比例混合常溫裂解lOmin，經離心、PBS洗后，以106/ml密度重懸于完全培養(yǎng)基中(a MEM, 10%胎牛血清，100U/ml青霉素，100 μ g/1111鏈霉素，25叩/1111兩性霉素^2111 M L-谷氨酰胺)，至于37° 5% CO2培養(yǎng)箱中。3 4天后去除不貼壁細胞，以后每4天換液一次。10 15天后細胞達到80% 90%融合,用O.25%胰酶/0. 1% EDTA消化傳代，體外培養(yǎng)擴增至第三代(P3)。麻醉下抽吸同一動物股骨和脛骨骨髓(4ml)，l IPBS稀釋后置于等體積的Ficoll淋巴分離液上，經密度梯度離心，PBS洗后以106/ml密度重懸于完全培養(yǎng)基中接種，本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種試劑盒，其特征在于一個試劑盒中包含G？CSF和CXCR4拮抗劑AMD3100，G？CSF含量為100ug/支，CXCR4拮抗劑AMD3100含量為5mg/支。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發(fā)人員：付維力，
申請(專利權)人：北京大學第三醫(yī)院，
類型：發(fā)明
國別省市：
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