一種孕婦外周血中胎兒游離DNA比例的定量方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開一種孕婦外周血中胎兒游離DNA比例的定量方法。本發(fā)明專利技術(shù)利用設(shè)計的引物將血漿中包含設(shè)計SNP的DNA提取出來，經(jīng)過一系列處理后上機，將測序產(chǎn)物比對到人類基因組序列后確定每個SNP位點的堿基。通過分析SNP中各堿基的比例來定量胎兒游離DNA濃度。本發(fā)明專利技術(shù)還可通過多個SNP來校正引入的誤差，用統(tǒng)計學(xué)的方法對多個SNP同時計算，提高計算出的胎兒游離DNA濃度準(zhǔn)確性。

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
一種孕婦外周血中胎兒游離DNA比例的定量方法
本專利技術(shù)涉及DNA定量領(lǐng)域，尤其涉及一種孕婦外周血中胎兒游離DNA比例的定量方法。
技術(shù)介紹
無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測是通過采集孕婦外周血(5ml)，提取其中的游離DNA，采用高通量測序技術(shù)，結(jié)合生物信息分析，得出胎兒患染色體非整倍體（21-三體又稱唐氏綜合征，18-三體，13-三體）的風(fēng)險。研究發(fā)現(xiàn)，從孕4周開始，在孕婦外周血中即可檢測到胎兒的游離DNA。隨著孕周增大，胎兒游離DNA含量也隨之增加。孕12周后，通過抽取孕婦外周血并從中提取出胎兒游離DNA，利用新一代基因測序技術(shù)并結(jié)合生物信息學(xué)分析手段，便可準(zhǔn)確判斷胎兒是否患有染色體病。該方法最佳檢測時間為孕早、中期，具有無創(chuàng)取樣、無流產(chǎn)風(fēng)險、高靈敏度，準(zhǔn)確性高的特點。無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測技術(shù)通過分析孕婦外周血中DNA來判斷胎兒是否存在染色體非整倍體，而不是針對性的分析胎兒的DNA，因此當(dāng)胎兒DNA比例過低時（<3%）,可能因為胎兒DNA量太少而不能被檢測出來染色體是否有異常，所以胎兒DNA的含量對檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和敏感性都起到了重要的作用。在一份檢測結(jié)果中，如果知道胎兒DNA的比例將是對一份結(jié)果準(zhǔn)確性的最好的復(fù)核。通過準(zhǔn)確的定量胎兒DNA的比例，設(shè)定該DNA比例下三體所對應(yīng)的閾值，對檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性起到復(fù)核作用，同時能夠避免孕周大但胎兒游離DNA濃度低造成的假陰性。雖然現(xiàn)在行業(yè)內(nèi)都通過接收孕12周以后的孕婦來減少這種情況的發(fā)生，但孕婦個體之間的差異還是可能存在胎兒DNA比例較低（2%的孕婦會因為胎兒DNA含量低而被要求重新抽血）。現(xiàn)有技術(shù)通過對男胎中含有的Y染色體信息來判斷男胎的濃度，對女胎還沒有有效的方法。現(xiàn)有技術(shù)中，甲基化定量胎兒游離DNA濃度的方法被很多研究證實可以用來定量胎兒游離DNA濃度。采用該方法抽取外周血后，經(jīng)DNA分離、甲基化敏感限制性內(nèi)切酶消除樣本中母源性(非甲基化)DNA，未分解的胎兒DNA在PCR擴增，最后定量胎兒DNA量。通過計算胎兒DNA量占外周血DNA量的比例來計算胎兒游離DNA濃度。但該方法還存在以下兩個缺點：1、被確定的穩(wěn)定的甲基化標(biāo)志基因較少，它需要具備兩個條件：1）孕婦和胎兒甲基化的差異要大，孕婦要完全不甲基化，胎兒要完全甲基化。2）甲基化差異必須保持穩(wěn)定,不會因為個人之間在數(shù)量或在懷孕期不同時期存在差異。2、甲基化定量胎兒游離DNA濃度的方法是通過一個基因，因為量少的原因需要經(jīng)過PCR來擴增，其中引入的誤差不好被校正。另外，還有一種方法是熒光定量PCR或者絕對定量PCR法，其也被用來定量胎兒游離DNA濃度，但其有個共同的缺點就是可用的目標(biāo)基因數(shù)據(jù)少，且能獲得DNA量也少，很容易有偏差。因此，現(xiàn)有技術(shù)還有待于改進和發(fā)展。
技術(shù)實現(xiàn)思路
鑒于上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本專利技術(shù)的目的在于提供一種定量孕婦外周血中胎兒游離DNA比例的方法，旨在解決現(xiàn)有的孕婦外周血DNA定量方法準(zhǔn)確性低、容易有偏差的問題。本專利技術(shù)的技術(shù)方案如下：一種孕婦外周血中胎兒游離DNA比例的定量方法，其中，包括步驟：A、設(shè)計位點：在人類基因組中，找出突變頻率在0.4-0.6的SNP位點；B、設(shè)計引物：根據(jù)設(shè)計的SNP位點，設(shè)計出覆蓋SNP位點的SNP引物；C、提取樣品DNA；D、擴增含有SNP位點的DNA片段：將樣品DNA、多重PCR反應(yīng)酶和SNP引物混勻后，進行PCR反應(yīng)得到PCR產(chǎn)物；E、純化擴增到的PCR產(chǎn)物；F、末端修復(fù)：將PCR產(chǎn)物、末端修復(fù)酶與末端修復(fù)酶緩沖液混合，室溫下孵育進行反應(yīng)得到混合DNA液；G、片段篩選：對步驟F所得混合DNA液進行片段篩選及純化，得到平末端DNA片段；H、接頭連接：將所得的平末端DNA片段與連接酶、連接酶緩沖液、及指定接頭混合后，室溫下孵育進行反應(yīng)得到混合DNA液；I、片段篩選：對步驟H所得混合DNA液進行片段篩選及純化，得到加接頭的DNA片段；J、PCR擴增：對所得加接頭的DNA片段進行PCR擴增及純化，得到小片段文庫；K、文庫檢測：對小片段文庫檢測濃度和片段大小；L、高通量測序：對檢測合格的小片段文庫進行高通量測序；M、數(shù)據(jù)預(yù)處理：將高通量測序得到的數(shù)據(jù)首先經(jīng)過低質(zhì)量過濾，篩選出長度大于100bp的序列；N、序列比對：將預(yù)處理后的序列與人類基因組序列進行比對；O、序列篩選：根據(jù)比對的結(jié)果，篩選出uniqueread的序列；P、SNP數(shù)據(jù)統(tǒng)計：根據(jù)比對結(jié)果及SNP位點的位置統(tǒng)計出SNP位點的覆蓋深度、堿基種類、每種堿基對應(yīng)數(shù)目；Q、根據(jù)統(tǒng)計結(jié)果，對每個SNP位點中四種堿基的出現(xiàn)次數(shù)進行排序，然后計算出SNP位點的覆蓋深度Depth，并根據(jù)排序結(jié)果求出SNP位點的測序錯誤率Error；根據(jù)每行的覆蓋深度Depth和測序錯誤率Error，求出SNP位點的平均覆蓋度和測序錯誤率的較大值ErrorUp；根據(jù)平均覆蓋度或者用戶自定的覆蓋深度，對SNP位點進行過濾；或根據(jù)每個SNP位點的測序錯誤率Error是否大于ErrorUp來過濾；R、計算每個SNP距離：對每一個SNP位點，計算出可能的胎兒游離DNA濃度Conc在四種SNP組合類型下所有SNP位點到相應(yīng)胎兒游離DNA濃度的距離TypeDistance；U、計算出總距離：找出每一SNP位點在四種SNP組合類型下對應(yīng)最小的TypeDistance，最后求和：AllDistance=sum（TypeDistancei），i=1…N，N為SNP位點總個數(shù)；V、選擇最優(yōu)的總距離：在Conc范圍內(nèi)計算出的AllDistance中選出其中最小的，其所對應(yīng)的Conc即為實際的胎兒游離DNA濃度。所述的孕婦外周血中胎兒游離DNA比例的定量方法，其中，所述步驟O中，篩選出錯配堿基在4個以下，且只比對到一處的序列，作為uniqueread。所述的孕婦外周血中胎兒游離DNA比例的定量方法，其中，所述步驟Q中，ErrorUp=(ErrorMean+ErrorSD*2),Errormean（Errori）i=1…N，N為SNP位點個數(shù)。所述的孕婦外周血中胎兒游離DNA比例的定量方法，其中，所述步驟U中，四種SNP組合類型為：類型1：母親和胎兒都是純合SNP；類型2：母親純合SNP，胎兒雜合SNP；類型3：母親雜合SNP，胎兒純合SNP；類型4：母親和胎兒都是雜合SNP。所述的孕婦外周血中胎兒游離DNA比例的定量方法，其中，所述步驟A中，在1-13、18及21這15條染色體上共選出1035個SNP位點。所述的孕婦外周血中胎兒游離DNA比例的定量方法，其中，Conc的范圍為0.025-0.5。所述的孕婦外周血中胎兒游離DNA比例的定量方法，其中，所述步驟R具體包括：按以下公式計算SNP距離Distance，Distance=abs(Major*A+Minor*B)/(A**2+B**2)**0.5,其中A，B是參數(shù)，具體如下：Type=1,A=Err/3,B=-(1-Err);Type=2,A=Conc/2*(1-Err)+(1-Conc/2)*Err/3,B=-((1-Conc/2)*(1-Err)+Conc/2*Err/3)；Type=3,A=(1/2-Conc/2)*(1-Err)+(1/2+Conc/2)*Err/3,B=-((1/2+Conc/2)本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護點】
一種孕婦外周血中胎兒游離DNA比例的定量方法，其特征在于，包括步驟：A、設(shè)計位點：在人類基因組中，找出突變頻率在0.4?0.6的SNP位點；B、設(shè)計引物：根據(jù)設(shè)計的SNP位點，設(shè)計出覆蓋SNP位點的SNP引物；C、提取樣品DNA；D、擴增含有SNP位點的DNA片段：將樣品DNA、多重PCR反應(yīng)酶和SNP?引物混勻后，進行PCR反應(yīng)得到PCR產(chǎn)物；E、純化擴增到的PCR產(chǎn)物；F、末端修復(fù)：將PCR產(chǎn)物、末端修復(fù)酶與末端修復(fù)酶緩沖液混合，室溫下孵育進行反應(yīng)得到混合DNA液；G、片段篩選：對步驟F所得混合DNA液進行片段篩選及純化，得到平末端DNA片段；H、接頭連接：將所得的平末端DNA片段與連接酶、連接酶緩沖液、及指定接頭混合后，室溫下孵育進行反應(yīng)得到混合DNA液；I、片段篩選：對步驟H所得混合DNA液進行片段篩選及純化，得到加接頭的DNA片段；J、PCR擴增：對所得加接頭的DNA片段進行PCR?擴增及純化，得到小片段文庫；K、文庫檢測：對小片段文庫檢測濃度和片段大小；L、高通量測序：對檢測合格的小片段文庫進行高通量測序；M、數(shù)據(jù)預(yù)處理：將高通量測序得到的數(shù)據(jù)首先經(jīng)過低質(zhì)量過濾，篩選出長度大于100bp的序列；N、序列比對：將預(yù)處理后的序列與人類基因組序列進行比對；O、序列篩選：根據(jù)比對的結(jié)果，篩選出unique?read的序列；P、SNP數(shù)據(jù)統(tǒng)計：根據(jù)比對結(jié)果及SNP位點的位置統(tǒng)計出SNP位點的覆蓋深度、堿基種類、每種堿基對應(yīng)數(shù)目；Q、根據(jù)統(tǒng)計結(jié)果，對每個SNP位點中四種堿基的出現(xiàn)次數(shù)進行排序，然后計算出SNP位點的覆蓋深度Depth，并根據(jù)排序結(jié)果求出SNP位點的測序錯誤率Error；根據(jù)每行的覆蓋深度Depth和測序錯誤率Error，求出SNP位點的平均覆蓋度和測序錯誤率的較大值ErrorUp；根據(jù)平均覆蓋度或者用戶自定的覆蓋深度，對SNP位點進行過濾；或根據(jù)每個SNP位點的測序錯誤率Error是否大于ErrorUp來過濾；R、計算每個SNP距離：對每一個SNP位點，計算出可能的胎兒游離DNA濃度Conc在四種SNP組合類型下所有SNP位點到相應(yīng)胎兒游離DNA濃度的距離TypeDistance；U、計算出總距離：找出每一SNP位點在四種SNP組合類型下對應(yīng)最小的TypeDistance，最后求和：AllDistance=sum（TypeDistancei），i=1…N，N為SNP位點總個數(shù)；V、選擇最優(yōu)的總距離：在Conc范圍內(nèi)計算出的AllDistance中選出其中最小的，其所對應(yīng)的Conc即為實際的胎兒游離DNA濃度。...

【技術(shù)特征摘要】
1.一種孕婦外周血中胎兒游離DNA比例的定量方法，其特征在于，包括步驟：A、設(shè)計位點：在人類基因組中，找出突變頻率在0.4-0.6的SNP位點；B、設(shè)計引物：根據(jù)設(shè)計的SNP位點，設(shè)計出覆蓋SNP位點的SNP引物；C、提取樣品DNA；D、擴增含有SNP位點的DNA片段：將樣品DNA、多重PCR反應(yīng)酶和SNP引物混勻后，進行PCR反應(yīng)得到PCR產(chǎn)物；E、純化擴增到的PCR產(chǎn)物；F、末端修復(fù)：將PCR產(chǎn)物、末端修復(fù)酶與末端修復(fù)酶緩沖液混合，室溫下孵育進行反應(yīng)得到混合DNA液；G、片段篩選：對步驟F所得混合DNA液進行片段篩選及純化，得到平末端DNA片段；H、接頭連接：將所得的平末端DNA片段與連接酶、連接酶緩沖液、及指定接頭混合后，室溫下孵育進行反應(yīng)得到混合DNA液；I、片段篩選：對步驟H所得混合DNA液進行片段篩選及純化，得到加接頭的DNA片段；J、PCR擴增：對所得加接頭的DNA片段進行PCR擴增及純化，得到小片段文庫；K、文庫檢測：對小片段文庫檢測濃度和片段大小；L、高通量測序：對檢測合格的小片段文庫進行高通量測序；M、數(shù)據(jù)預(yù)處理：將高通量測序得到的數(shù)據(jù)首先經(jīng)過低質(zhì)量過濾，篩選出長度大于100bp的序列；N、序列比對：將預(yù)處理后的序列與人類基因組序列進行比對；O、序列篩選：根據(jù)比對的結(jié)果，篩選出uniqueread的序列；P、SNP數(shù)據(jù)統(tǒng)計：根據(jù)比對結(jié)果及SNP位點的位置統(tǒng)計出SNP位點的覆蓋深度、堿基種類、每種堿基對應(yīng)數(shù)目；Q、根據(jù)統(tǒng)計結(jié)果，對每個SNP位點中四種堿基的出現(xiàn)次數(shù)進行排序，然后計算出SNP位點的覆蓋深度Depth，并根據(jù)排序結(jié)果求出SNP位點的測序錯誤率Error；根據(jù)每行的覆蓋深度Depth和測序錯誤率Error，求出SNP位點的平均覆蓋度和測序錯誤率的較大值ErrorUp；根據(jù)平均覆蓋度或者用戶自定的覆蓋深度，對SNP位點進行過濾；或根據(jù)每個SNP位點的測序錯誤率Error是否大于ErrorUp來過濾；R、計算每個SNP距離：對每一個SNP位點，計算出可能的胎兒游離DNA濃度Conc在四種SNP組合類型下所有SNP位點到相應(yīng)胎兒游離DNA濃度的距離TypeDistance；U、計算出總距離：找出每一SNP位點在四種SNP組合類型下對應(yīng)最小的TypeDistance，最后求和：AllDistance=sum（TypeDistance...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：陳洪亮，鄭海靈，祝興強，段利朋，
申請(專利權(quán))人：廈門萬基生物科技有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：福建;35