本發明專利技術公開了分離富集外周血中CD4+和CD25+調節性淋巴細胞的方法，更好地為CD4+和CD25+調節性淋巴細胞進行后續研究提供基礎，涉及生物醫學領域。方法包括多臂井星聚合物與鼠抗人CD4+或CD25+單克隆抗體共價偶聯、鼠抗人CD4+或CD25+單克隆抗體修飾的多臂井星聚合物再包被長鏈生物素分子、鼠抗人CD4+或CD25+單克隆抗體和長鏈生物素共修飾的多臂井星聚合物捕獲外周血樣品中的CD4+和CD25+淋巴細胞、鏈霉親和素修飾的納米磁珠識別并偶聯外周血中長鏈生物素化多臂井星聚合物、被捕獲CD4+和CD25+淋巴細胞的分離及重懸等步驟。重懸液可以直接進行后續分析，與傳統的細胞分離方法相比，該方法更適用于在復雜外周血樣品中對CD4+和CD25+淋巴細胞進行磁分離，提高了外周血樣品中CD4+和CD25+淋巴細胞分離效率。
【技術實現步驟摘要】
【技術保護點】
利用磁珠分離人外周血中CD4+和CD25+淋巴細胞的方法，其特征在于包括以下步驟：（1）每取1.0?mg多臂井星聚合物溶解于2?mL，0.02?M，pH?6.5?PBS，加入0.6?mg?NHSS，0.4?mg?EDC，室溫置于混勻儀上攪拌，活化15?min；取2.1?mg?鼠抗人CD4+抗體加入上述反應液中，室溫置于混勻儀上攪拌30?min；將上述溶液減壓旋干溶劑，去離子水溶解，在PBS和去離子水中透析1?d；透析結束將得到的溶液冷凍干燥得多臂井星聚合物?鼠抗人CD4+抗體復合物；（2）每取1.0?mg多臂井星聚合物溶解于2?mL，0.02?M，pH?6.5?PBS，加入0.6?mg?NHSS，0.4?mg?EDC，室溫置于混勻儀上攪拌，活化15?min；取2.1?mg?鼠抗人CD25+抗體加入上述反應液中，室溫置于混勻儀上攪拌30?min；將上述溶液減壓旋干溶劑，去離子水溶解，在PBS和去離子水中透析1?d；透析結束將得到的溶液冷凍干燥得多臂井星聚合物?鼠抗人CD25+抗體復合物；（3）每取15?mg?長鏈生物素，5.4?mg?NHSS，3.6?mg?EDC溶解于3?mL?0.02?M?pH?6.5?PBS緩沖液中；將0.1?mg多臂井星聚合物?鼠抗人CD4+或CD25+抗體復合物加入到上述溶液中，室溫置于混勻儀上攪拌30?min；將上述溶液減壓旋干溶劑，去離子水溶解，在PBS和去離子水中透析1?d；透析結束將得到的溶液冷凍干燥長鏈生物素?多臂井星聚合物?抗體復合物；（4）富集捕獲：取待測樣品溶液1mL，加入0.1?mg?長鏈生物素?多臂井星聚合物?CD4+抗體復合物，置于混勻儀上，以30?rpm的轉速室溫孵育15?min形成長鏈生物素?多臂井星聚合物?抗體?CD4+細胞抗原復合物；加入0.1?mg修飾有鏈霉親和素的納米磁珠，置于混勻儀上，以30?rpm的轉速再室溫孵育15?min，將離心管插入常規磁力架充分分離；磁分離后，用等體積的PBS溶液重懸細胞，即為CD4+細胞；將分離后的上清液用等體積的PBS溶液洗滌，離心300rpm/min，20℃?10?min，棄去上清，用等體積的PBS溶液重懸細胞；加入0.1?mg?長鏈生物素?多臂井星聚合物?CD25+抗體復合物，置于混勻儀上，以30?rpm的轉速室溫孵育15?min形成長鏈生物素?多臂井星聚合物?抗體?CD25+細胞抗原復合物；加入0.1?mg修飾有鏈霉親和素的納米磁珠，置于混勻儀上，以30?rpm的轉速再室溫孵育15?min，將離心管插入常規磁力架充分分離；磁分離后，用等體積的PBS溶液重懸細胞，即為CD25+細胞；（5）去離子水輕輕清洗后，用PBS緩沖液混重懸即得富集有CD4+或CD25+細胞的復合物即納米磁珠?鏈霉親和素?生物素?多臂井星聚合物?抗體?CD4+CD25+細胞。...
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：許恒毅，魏華，熊勇華，賴衛華，
申請(專利權)人：南昌大學，
類型：發明
國別省市：
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