一種檢測豬外周血和脾臟淋巴細胞膜表面分子的樣品制備試劑盒及其制備方法技術

本發明專利技術公開一種適用于流式細胞術檢測豬外周血和脾臟淋巴細胞膜表面分子的樣品制備試劑盒及其制備方法。其中，所述的制備方法將豬的外周血或脾臟獲取生物樣品并制成細胞粗提混懸液；將粗提液轉入離心管后，加入紅細胞裂解液經冰浴裂解紅細胞，離心除去上清，收集沉淀細胞；用緩沖液I重懸細胞，并計數細胞；用緩沖液II重懸細胞，并加入熒光素標記的細胞膜表面抗體，冰浴30min；再用緩沖液I洗滌細胞后，將細胞懸浮于緩沖液III。本發明專利技術所制備的樣品可在常溫保存或長途運輸以備流式細胞儀的檢測，檢測結果高效而穩定。

【技術實現步驟摘要】
一種檢測豬外周血和脾臟淋巴細胞膜表面分子的樣品制備試劑盒及其制備方法
本專利技術涉及豬外周血和脾臟淋巴細胞膜表面分子的流式細胞檢測技術，特別提供了適用于條件較差的基層豬場實驗室的流式細胞樣品制備方法。
技術介紹
我國是豬肉生產和消費的大國。在國際上，我國生豬存欄量、屠宰量以及豬肉產量已多年占據世界首位。國家統計局數據顯示，2012年我國豬肉產量5335萬噸，同比增長5.6％。我國養殖業在世界有著舉足輕重的地位。自80年以來，中國養豬業進入了由農戶養豬向集約化和產業化轉型期，養豬科學技術也取得了長足的進步。然而，養豬業也正面臨著豬病和食品安全的極度困擾。由于豬病流行日趨復雜化以及科學養豬理念的深入人心，越來越多的規模化豬場開始籌備建立獸醫實驗室來有效監控豬病，為豬群的保健提供技術支持。但是典型的豬場實驗室只能完成大體病理學解剖，顯微鏡檢驗，血清學檢驗和簡單的生化檢測。而多數流行性疾病的診斷，疫苗免疫效果檢測和飼用添加劑功效檢驗等尚需做細胞免疫反應相關指標的檢驗，該檢驗的常規儀器——流式細胞儀屬于高端科研型儀器，絕大多數基層實驗室都尚未配備，限制了細胞學檢驗的有效實施。流式細胞術是一種基于熒光手段的生物學檢測技術，廣泛應用于細胞計數，分選和生物標記物檢測。主要原理是將單細胞懸液用一定壓力壓入流動室，細胞呈單行排列依次通過檢測區域，收集監測數據后對數據進行分析。外周血、骨髓穿刺物，組織活檢物等樣本等都可用流式細胞術分析。但是樣本的條件控制是待檢樣本質量控制的最關鍵環節，這對于樣本的采集、保存、運輸和制備均提出了較高的要求。如溶血、壞死的樣本均不適于流式檢測。常規流式細胞術檢驗前，細胞樣品經過分離、染色等一系列處理后應即時或盡快上機檢驗。但是若將待檢動物或組織冷凍保存并運輸至高校或科研機構再制備細胞樣品的話，不但加重了運輸成本也使得檢測過程復雜化，費時費力。在基層實驗室先進行細胞樣品的制備，并妥善保存后運送至流式檢測平臺可為解決這一問題提供提一條很好的策略。細胞內分子檢測，可先固定細胞長期保存。但是，在染色前固定細胞的話可能會破壞膜表面蛋白分子的結構，不利于膜表面蛋白分子的檢測(如T細胞表面CD3，CD4等)。而且，基層實驗室無菌級別較低，所制備樣品保存時間過久可能誘發細菌大量增殖而導致流式檢測失敗。另外，流式染色過程中，非特異性染色或染色強度較弱都對檢測結果造成不利影響。由此可見，在豬場實驗室的簡易條件下制備高質量的細胞樣本，并可將樣本長途運輸至檢測目的地是目前豬場疾病防控管理與研發工作迫切需要解決的問題。然而目前為止，尚未見較為成熟可行的適于基層豬場流式細胞術檢測樣品制備的方法。
技術實現思路
為了解決上述基層豬場流式細胞術分析樣品的制備方法問題，本專利技術的目的是提供了一種適用于利用流式細胞術進行豬外周血和脾臟淋巴細胞膜表面抗原檢測的樣品制備方法，實現檢測樣品的長途運輸和保存，檢測結果高效而穩定。為實現上述目的，本專利技術首先提供一種適用于流式細胞術檢測豬外周血和脾臟淋巴細胞膜表面分子的樣品制備試劑盒，包括緩沖液I、緩沖液II和緩沖液III，所述緩沖液I為含100-800U/ml青霉素，100-800μg/ml鏈霉素，1-8μg/ml兩性霉素B的PBS緩沖液，pH值為7.2-7.4；所述緩沖液II為含2mMEDTA,0.2％-0.6％BSA，100-800U/ml青霉素，100-800μg/ml鏈霉素，1-8μg/ml兩性霉素B的PBS緩沖液，pH值為7.2-7.4；所述緩沖液III為含0.1％NaN3，1％-5％多聚甲醛的PBS緩沖液，pH值為7.2-7.4。在本專利技術一個優選的實施方案中，所述緩沖液I為含500U/ml青霉素，500μg/ml鏈霉素，5μg/ml兩性霉素B的PBS緩沖液，pH值為7.2-7.4；所述緩沖液II為含2mMEDTA,0.5％BSA，500U/ml青霉素，500μg/ml鏈霉素，5μg/ml兩性霉素B的PBS緩沖液，pH值為7.2-7.4；所述緩沖液III為含0.1％NaN3，2％多聚甲醛的PBS緩沖液，pH值為7.2-7.4。進一步地，本專利技術的試劑盒還可優選包括紅細胞裂解液，所述紅細胞裂解液主要成分為：0.16MNH4Cl，0.13mMEDTA，12mMNaHCO3，pH值為7.2。進一步地，本專利技術還提供一種利用所述的試劑盒進行豬外周血和脾臟淋巴細胞膜表面抗原流式細胞術檢測的樣品制備方法，其包括采集豬外周血和豬脾臟組織，制備淋巴細胞單細胞懸液，裂解紅細胞后用抗體染色后固定，直至用流式細胞儀進行檢測。在本專利技術一個具體實施方案中，所述的制備方法，為將豬的外周血或脾臟獲取生物樣品并制成細胞粗提混懸液；將粗提液轉入離心管后，加入紅細胞裂解液經冰浴裂解紅細胞，離心除去上清，收集沉淀細胞；用緩沖液I重懸細胞，并計數細胞；用緩沖液II重懸細胞，并加入熒光素標記的細胞膜表面抗體，冰浴30min；再用緩沖液I洗滌細胞后，將細胞懸浮于緩沖液III，以備流式細胞儀的檢測。在本專利技術一個優選的實施方案中，所述的制備方法具體包括如下步驟：1)細胞粗提懸液制備：利用EDTA抗凝真空采血管采集豬外周血即為血細胞粗提液；剪取脾臟組織約0.5cm3放入平皿中，除去被膜和結締組織，在200目尼龍膜上研磨脾臟使磨碎的細胞通過尼龍網懸浮于2ml緩沖液I，即為脾臟細胞粗提懸液；2)向上述粗提液中加入3倍體積的紅細胞裂解液，顛倒混勻；3)冰上孵育5分鐘,其間混勻兩次；4)450×g離心5分鐘收集沉淀細胞，小心吸棄上清液；5)向細胞沉淀中加入兩倍體積紅細胞裂解液，裂解殘余紅細胞；6)重復步驟3和4；7)用緩沖液I緩沖液重懸細胞，并以450×g離心5分鐘洗滌細胞，并用血平板計數細胞；8)用緩沖液II重懸細胞(106個細胞/100μl)，并加入熒光素標記的細胞膜表面抗體，混勻后冰浴30min；9)向上述液體中加緩沖液I至1ml，以450×g離心5分鐘洗滌細胞；10)用緩沖液III懸浮細胞(106個細胞/100μl)，所制備樣品可在常溫保存或長途運輸以備流式細胞儀的檢測。其中，檢測的對象包括豬的血液、脾臟所提取的細胞，適用的抗原分子主要為細胞表面分子；獲取組織臟器采用解剖方法，解剖工具可以為手術刀，手術剪和手術鑷。本專利技術具有如下優點：1.本專利技術的方法簡便易行，所用均為實驗室常規試劑材料和儀器，適用于條件較為簡易的基層豬場實驗室。2.本專利技術所制備的細胞樣品，可在常溫下保存和運輸，流式細胞術檢測結果高效而穩定。有效延長了樣品保存期限，樣品保存10天時檢測結果依然穩定，克服了基層試驗場流式檢測技術的瓶頸。3.本專利技術各步驟所用試劑均含抗菌或防腐成分，有效克服了在無菌級別較低的實驗室環境中制備細胞容易造成的污染問題。4.本專利技術在緩沖液II中含有助染劑及封閉劑，有效增強特異性著色，抑制抗原抗體的非特異性結合，提高了制備樣品的質量。5.應用范圍廣。本專利技術適用于基層豬場條件下豬外周血和脾臟淋巴細胞表面抗原的流式細胞術檢測樣品制備。可應用包括CD3，CD4，CD8，CD25，CD69等膜表面分子的檢測。附圖說明圖1所示為豬外周血淋巴細胞樣品制備后當天和10天后檢測結果。圖2所示為豬脾臟淋巴細胞樣品制備后當天和10天后檢測結果。具體實施方式以下實施本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種適用于流式細胞術檢測豬外周血和脾臟淋巴細胞膜表面分子的樣品制備試劑盒，包括緩沖液I、緩沖液II和緩沖液III，所述緩沖液I為含100?800U/ml青霉素，100?800μg/ml鏈霉素，1?8μg/ml兩性霉素B的PBS緩沖液，pH值為7.2?7.4；所述緩沖液II為含2mMEDTA,0.2%?0.6%BSA，100?800U/ml青霉素，100?800μg/ml鏈霉素，1?8μg/ml兩性霉素B的PBS緩沖液，pH值為7.2?7.4；所述緩沖液III為含0.1%NaN3，1%?5%多聚甲醛的PBS緩沖液，pH值為7.2?7.4。

【技術特征摘要】
1.一種適用于流式細胞術檢測豬外周血和脾臟淋巴細胞膜表面分子的樣品制備試劑盒，包括緩沖液I、緩沖液II和緩沖液III，所述緩沖液I為含100-800U/ml青霉素，100-800μg/ml鏈霉素，1-8μg/ml兩性霉素B的PBS緩沖液，pH值為7.2-7.4；所述緩沖液II為含2mMEDTA,0.2％-0.6％BSA，100-800U/ml青霉素，100-800μg/ml鏈霉素，1-8μg/ml兩性霉素B的PBS緩沖液，pH值為7.2-7.4；所述緩沖液III為含0.1％NaN3，1％-5％多聚甲醛的PBS緩沖液，pH值為7.2-7.4。2.如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述緩沖液I為含500U/ml青霉素，500μg/ml鏈霉素，5μg/ml兩性霉素B的PBS緩沖液，pH值為7.2-7.4；所述緩沖液II為含2mMEDTA,0.5％BSA，500U/ml青霉素，500μg/ml鏈霉素，5μg/ml兩性霉素B的PBS緩沖液，pH值為7.2-7.4；所述緩沖液III為含0.1％NaN3，2％多聚甲醛的PBS緩沖液，pH值為...

【專利技術屬性】
技術研發人員：蘇華荔，王安如，
申請(專利權)人：北京大北農科技集團股份有限公司，浙江大北農農牧科技有限公司，漳州大北農農牧科技有限公司，
類型：發明
國別省市：