一種RNA的預(yù)備模板PCR檢測(cè)方法技術(shù)

本發(fā)明專(zhuān)利技術(shù)提供了一種RNA的預(yù)備模板PCR（Template-Ready?PCR，TRPCR）檢測(cè)方法。本發(fā)明專(zhuān)利技術(shù)方法與采用傳統(tǒng)的RT-PCR方法相比，不需要純化抽提RNA，不需要進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，將原本長(zhǎng)達(dá)3個(gè)小時(shí)以上的PCR前處理過(guò)程縮短為約50分鐘，因此，操作簡(jiǎn)便快速易行，具有較高的RNA檢測(cè)的靈敏度和特異性，適合對(duì)各種來(lái)源的樣品裂解得到RNA進(jìn)行檢測(cè)。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專(zhuān)利技術(shù)涉及一種RNA的預(yù)備模板PCR (Template-Ready PCR, TRPCR)檢測(cè)方法。
技術(shù)介紹
RNA是遺傳信息傳遞的載體。RT-PCR (reverse transcription逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng))，指將逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(Reverse Transcription, RT)和 PCR (Polymerase ChainReaction)反應(yīng)組合在一起的方法.RT- PCR將以RNA為模板的cDNA合成，即RT，同PCR結(jié)合在一起，提供了一種分析基因表達(dá)的快速靈敏的方法。RNA的RT-PCR檢測(cè)或定量分析，比其他包括Northern印跡、RNase保護(hù)分析、原位雜交及SI核酸酶分析在內(nèi)的RNA分析技術(shù)，更靈敏，更易于操作，已發(fā)展成為進(jìn)行基因表達(dá)水平的檢測(cè)分析，病原體的檢測(cè)分析等 有力的手段。RT-PCR的模板可以為總RNA或poly (A) +RNA.其中RT需要用逆轉(zhuǎn)錄酶，可以用隨機(jī)引物、oligo (dT)或基因特異性的引物(GSP)起始.RT和PCR可以在兩個(gè)反應(yīng)管中分步先后進(jìn)行(兩管法)，也可以在一個(gè)反應(yīng)管中先后進(jìn)行(一管法)。兩管法比較常見(jiàn)，在兩管法RT-PCR中，每一步都可以盡量在最佳條件下進(jìn)行，但由于RT體系中含有PCR抑制物，所以一般只能取出約5%的RT產(chǎn)物進(jìn)行PCR，這限制了最終檢測(cè)的靈敏度，但在使用一個(gè)樣品檢測(cè)多個(gè)目標(biāo)RNA時(shí)比較很有用——因?yàn)橐粋€(gè)RT產(chǎn)物可以分別用于很多個(gè)PCR反應(yīng)。一管法RT-PCR中，RT和PCR在一只管中進(jìn)行，必須盡可能地提供同時(shí)為逆轉(zhuǎn)錄和PCR優(yōu)化的條件.一步法RT-PCR在處理大量樣品時(shí)易于操作，有助于減少殘余污染，因?yàn)樵赾DNA合成和擴(kuò)增之間不需要打開(kāi)管蓋.一步法優(yōu)化成功的話，可以得到更高的靈敏度，最低可以達(dá)到0. Ipg總RNA，這是因?yàn)檎麄€(gè)cDNA樣品都被擴(kuò)增-理論上靈敏度可以比兩管法提高20倍.然而，為一步法RT-PCR優(yōu)化的條件很難掌控，經(jīng)常會(huì)帶來(lái)嚴(yán)重的非特異擴(kuò)增，而且成本上有很大提升.雖然RT-PCR在科研領(lǐng)域的推廣普及程度很高，但在臨床檢測(cè)應(yīng)用方面，仍存在很大的改進(jìn)空間.主要問(wèn)題包括步驟繁瑣，對(duì)操作要求高，特別是2種酶促反應(yīng)(RT和PCR)的最優(yōu)反應(yīng)條件是有差異的，容易受到各種抑制物質(zhì)的影響，也容易受到非特異擴(kuò)增和假陽(yáng)性的困擾，最后，逆轉(zhuǎn)錄酶的價(jià)格居高不下，操作成本很難降下來(lái).
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專(zhuān)利技術(shù)目的是提供一種操作簡(jiǎn)單快速、特異性強(qiáng)的用于RNA檢測(cè)的預(yù)備模板PC檢測(cè)方法。本專(zhuān)利技術(shù)采用的技術(shù)方案是一種RNA的預(yù)備模板PCR檢測(cè)方法，所述方法包括(I)設(shè)計(jì)與目標(biāo)RNA上任意一段序列互補(bǔ)的長(zhǎng)度為25 40mer的單鏈寡核苷酸DNA，記為探針A ;探針A的GC含量為40-60%，解鏈溫度(Tm值)為70_85°C ;將探針A錨定在PCR管內(nèi)，得到錨定PCR管；探針A的錨定可以采用本領(lǐng)域常規(guī)方法進(jìn)行，用于錨定探針A的固體介質(zhì)，可以是塑料離心管，也可以是磁珠，凝膠顆粒或其他可以吸附結(jié)合核酸的固體介質(zhì)；(2)設(shè)計(jì)部分序列與目標(biāo)RNA上任意的另一段序列互補(bǔ)的單鏈寡核苷酸DNA，其結(jié)構(gòu)為兩端是特異的長(zhǎng)度為2(T30mer的PCR引物序列、中間為與目標(biāo)RNA互補(bǔ)的長(zhǎng)度為25 40merbp的序列，記為探針B ;探針B的GC含量為40_60%，解鏈溫度(Tm值)為70_85°C，與探針A和目標(biāo)RNA的結(jié)合區(qū)域互不重疊。(3)取待測(cè)樣本，加入探針B和裂解液，反復(fù)吸打，轉(zhuǎn)移至離心管中，冰上放置20min, 4°C離心，取上清液，得到裂解上清液；所述裂解液為本領(lǐng)域常規(guī)含有表面活性劑(如吐溫20、NP-40等)、用于細(xì)胞或組織裂解的緩沖液；待測(cè)樣本可來(lái)自組織或細(xì)胞，或者臨床標(biāo)本如痰液、血液等； 待測(cè)樣本來(lái)自痰液時(shí)，裂解上清液獲得方法如下1飛ml痰液+ 5^10 ml痰融液，37。。振蕩IOmin, 4°C >5000 rpm離心IOmin,棄上清,取沉淀+ 200 ul裂解液(其中探針8濃度為1_01/1)，反復(fù)吸打，轉(zhuǎn)移到1.5 ml離心管中，冰上放置20min，4°C、15000 rpm離心20min，取上清，得到裂解上清液；痰融液組成PBS+O. 1% (w/vol)DTT0待測(cè)樣本來(lái)自細(xì)胞時(shí)，裂解上清液獲得方法如下24孔板細(xì)胞培養(yǎng)，吸去培養(yǎng)液，+ 200ul裂解液(其中探針B濃度為lnmol/Lol/L)，反復(fù)吸打，轉(zhuǎn)移到1.5 ml離心管中，冰上放置20min，4°C、15000 rpm離心20min，取上清，得到裂解上清液；待測(cè)樣本來(lái)自組織時(shí)，裂解上清液獲得方法如下取約0. lmmol/L3大小的組織塊放入I. 5 ml離心管中，+ 200ul裂解液(其中探針B濃度為lnmol/Lol/L)，用吸頭搗碎組織，室溫振蕩IOmin, 4°C、15000 rpm離心20min,取上清,得到裂解上清液；(4)取裂解上清液20uL至錨定PCR管中，6(T70°C保溫5 15min，吸干管內(nèi)液體，以洗滌液洗滌3、次，吸干，加入20uL由PCR緩沖液和PCR引物(該P(yáng)CR引物即與探針B兩端的PCR引物序列相同的引物對(duì))配制的PCR反應(yīng)液(PCR反應(yīng)液中引物對(duì)濃度為0. 2umol/Lol/L)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行SYBR熒光定量分析；所述緩沖液為PCR反應(yīng)常規(guī)緩沖液；所述洗滌液可為本領(lǐng)域常規(guī)含有表面活性劑(如吐溫20、NP-40等)的緩沖液。在雜交反應(yīng)之后，通過(guò)多次反復(fù)的洗滌，在洗去未雜交結(jié)合的核酸的同時(shí)，也洗去了其他可能干擾PCR反應(yīng)的物質(zhì)，從而保證了 PCR反應(yīng)的特異性和成功率；(5)以空白裂解液作為陰性對(duì)照，按照步驟(I)和(2)方法進(jìn)行處理和分析，以樣本Ct值小于空白裂解液Ct值判斷為陽(yáng)性。本專(zhuān)利技術(shù)方法原理如下(1)預(yù)先制備好與目標(biāo)RNA上一段序列互補(bǔ)的錨定探針——探針A ;探針A被固定在PCR管壁，磁珠或其他可吸附結(jié)合核酸的固體介質(zhì)上，作用是通過(guò)特異性地結(jié)合目標(biāo)RNA,將目標(biāo)RNA選擇性地吸附在固體介質(zhì)上；(2)與目標(biāo)RNA上另一段序列互補(bǔ)的模板探針——探針B ;探針B兩端帶有PCR引物序列，使用時(shí)是添加在裂解液中的；當(dāng)細(xì)胞被裂解后，探針B通過(guò)部分雜交與目標(biāo)RNA結(jié)合，這樣探針B也就被選擇性地吸附在上述固體介質(zhì)上；(3)在雜交反應(yīng)之后，經(jīng)過(guò)反復(fù)清洗，只有能與探針A互補(bǔ)雜交結(jié)合的目標(biāo)RNA分子及與該RNA雜交結(jié)合的探針B留在反應(yīng)管中；(4)由于探針B兩端帶有PCR引物序列，這樣加入PCR反應(yīng)液后，以探針B為模板，不需要RT，可直接進(jìn)行PCR反應(yīng)。優(yōu)選的，所述裂解液組成如下l%(w/vol)SDS, 500mmol/Lol/L NaCl, 2mmol/Lol/L MgCI o, 10mmol /LoI /T, 2_ 疏基乙醇，0. lmg/ml 魚(yú)精 DNA (市購(gòu))，0. 1% (vol/vol)Tween20,1% (w/vol)脫脂奶粉，溶劑為 10mmol/Lol/L、pH7. 5 的 Tris-HCl。優(yōu)選的，所述PCR 緩沖液組成如下50mmol/Lol/L KCl, I. 5mmol/Lol/L MgCl2,0.2mmol/Lol/L dNTP，5% (vol/vol) DMSO,0. 05% (vol/vol本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種RNA的預(yù)備模板PCR檢測(cè)方法，所述方法包括：（1）設(shè)計(jì)與目標(biāo)RNA上任意一段序列互補(bǔ)的長(zhǎng)度為25~40mer的單鏈寡核苷酸DNA，記為探針A；探針A的GC含量為40~60%，解鏈溫度為70~85℃；將探針A錨定在PCR管內(nèi)，得到錨定PCR管；（2）設(shè)計(jì)部分序列與目標(biāo)RNA上另一段任意序列互補(bǔ)的單鏈寡核苷酸DNA，其結(jié)構(gòu)為:？?jī)啥耸翘禺惖拈L(zhǎng)度為20~30mer的PCR引物序列、中間為與目標(biāo)RNA互補(bǔ)的長(zhǎng)度為25~40mer的序列，記為探針B；探針B？的GC含量為40~60%，解鏈溫度為70~85℃，與探針A和目標(biāo)RNA的結(jié)合區(qū)域互不重疊；（3）取待測(cè)樣本，加入探針B和含表面活性劑的細(xì)胞裂解液，反復(fù)吸打，轉(zhuǎn)移至離心管中，冰上放置20min，4℃離心，取上清液，得到裂解上清液；（4）取裂解上清液20uL至錨定PCR管中，60~70℃保溫5~15min，吸干管內(nèi)液體，以洗滌液洗滌3~9次，吸干，加入20uL？由PCR緩沖液和PCR引物配制的PCR反應(yīng)液，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行熒光定量分析；（5）以空白裂解液作為陰性對(duì)照，按照步驟（1）和（2）方法進(jìn)行處理和分析，以樣本Ct值小于空白裂解液Ct值判斷為陽(yáng)性。...

【技術(shù)特征摘要】

【專(zhuān)利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：陳燃，伍迪，金曉錚，
申請(qǐng)(專(zhuān)利權(quán))人：浙江今復(fù)康生物科技有限公司，
類(lèi)型：發(fā)明
國(guó)別省市：