本發(fā)明專利技術(shù)涉及直接重新接種收集的在中空纖維生物反應(yīng)器中生長的貼壁細(xì)胞的方法。本發(fā)明專利技術(shù)還公開了一種用于將貼壁細(xì)胞直接重新接種在中空纖維生物反應(yīng)器中的收集培養(yǎng)基。
【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
【國外來華專利技術(shù)】優(yōu)先權(quán)本專利申請(qǐng)要求于2010年5月5日提交的臨時(shí)專利申請(qǐng)61/331，660的優(yōu)先權(quán)，且本專利申請(qǐng)是于2008年3月5日提交的美國專利申請(qǐng)12/042，763的部分接續(xù)申請(qǐng)。
技術(shù)介紹
在多種處理和治療中，干細(xì)胞的使用正受到越來越多的關(guān)注。干細(xì)胞可被用于修復(fù)或替代受損或有缺陷的組織，且具有治療大范圍疾病的廣泛的臨床應(yīng)用。細(xì)胞擴(kuò)增系統(tǒng)可用于使干細(xì)胞以及其它類型的細(xì)胞(貼壁細(xì)胞和非貼壁細(xì)胞)生長。在細(xì)胞將要生長和分裂前，貼壁細(xì)胞需要貼附的表面。而非貼壁細(xì)胞在懸浮液中漂浮的同時(shí)進(jìn)行生長和分裂。 細(xì)胞擴(kuò)增系統(tǒng)為生長的細(xì)胞提供營養(yǎng)物且移除代謝物，以及供應(yīng)有助于細(xì)胞生長的生理化學(xué)環(huán)境。細(xì)胞擴(kuò)增系統(tǒng)在本領(lǐng)域是已知的。生物反應(yīng)器或細(xì)胞生長腔體作為細(xì)胞擴(kuò)增系統(tǒng)的組件在為擴(kuò)增的細(xì)胞提供最優(yōu)化環(huán)境中起到重要作用。在本領(lǐng)域中已知很多類型的生物反應(yīng)器。生物反應(yīng)器裝置包括培養(yǎng)瓶、轉(zhuǎn)瓶(roller bottle)、振蕩瓶(shaker flask)、攪拌槽式反應(yīng)器(stirred_tankreactor)、氣升式反應(yīng)器(air-lift reactor)和中空纖維生物反應(yīng)器。—旦生物反應(yīng)器中擴(kuò)增的細(xì)胞達(dá)到細(xì)胞覆蓋或期望的細(xì)胞數(shù)量，則需要收集細(xì)胞，且如果期望進(jìn)ー步的細(xì)胞生長，則需要將細(xì)胞重新接種在相同或不同的生物反應(yīng)器中。不管使用何種類型的生物反應(yīng)器裝置，為了收集貼壁細(xì)胞，必須首先從細(xì)胞生長的表面上移除細(xì)胞。為了從生長表面移除貼壁細(xì)胞，初始清洗細(xì)胞以移除抑制胰蛋白酶的離子(鎂、鈣)。然后將胰蛋白酶添加至經(jīng)清洗的細(xì)胞以使細(xì)胞從表面松落。一旦細(xì)胞被松落，則從膜表面移除它們，且通過清洗被移除的細(xì)胞或使它們旋轉(zhuǎn)沉淀為細(xì)胞團(tuán)、移除周圍的流體且將它們懸浮在新的生長培養(yǎng)基中進(jìn)行處理以移除胰蛋白酶。該程序容易在細(xì)胞生長在平板上的開放系統(tǒng)(諸如培養(yǎng)瓶)中進(jìn)行，其中該程序在層流凈化罩中進(jìn)行。但是在使用中空纖維生物反應(yīng)器的封閉系統(tǒng)中，該系統(tǒng)對(duì)大氣是封閉的。沒有簡單的方法來添加流體或從系統(tǒng)中移除流體，且包含在細(xì)胞生長所需的生長培養(yǎng)基中的離子由于通過中空纖維的超濾而從細(xì)胞生長空間中丟失。因此細(xì)胞存活在被稀釋的培養(yǎng)基(來自從細(xì)胞初始清洗進(jìn)入系統(tǒng)的添加的流體)、胰蛋白酶(來自用于使細(xì)胞從膜松落的胰蛋白酶)、且由于超濾培養(yǎng)基中沒有離子(例如鈣和鎂)圍繞的環(huán)境中。這些因素可造成被直接重新接種在中空纖維生物反應(yīng)器中的收集的貼壁細(xì)胞的細(xì)胞生長不足。因此，需要開發(fā)新的重新接種的方案以在使用中空纖維生物反應(yīng)器的細(xì)胞擴(kuò)增系統(tǒng)中使用
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)涉及用于直接重新接種收集的在中空纖維生物反應(yīng)器中生長的貼壁細(xì)胞的方法，所述中空纖維生物反應(yīng)器具有內(nèi)毛細(xì)管空間(intracapillary space)和外毛細(xì)管空間(extracapillary space),其中細(xì)胞生長空間是內(nèi)毛細(xì)管空間或外毛細(xì)管空間中的一種。該方法包括以下步驟從所述細(xì)胞生長空間移除生長培養(yǎng)基；清洗所述細(xì)胞以從所述細(xì)胞生長空間移除殘留的生長培養(yǎng)基；通過將胰蛋白酶添加至所述細(xì)胞生長空間，使所述細(xì)胞從中空纖維生物反應(yīng)器的中空纖維上松落；從所述細(xì)胞生長空間移除細(xì)胞和所有胰蛋白酶；使來自被移除的細(xì)胞中的胰蛋白酶失活；以及，將被移除的細(xì)胞和胰蛋白酶直接重新接種在中空纖維生物反應(yīng)器的細(xì)胞生長空間中。本專利技術(shù)還要求了一種制造收集培養(yǎng)基的方法，所述方法通過使用Chvh+Ov0K =CfVh+Cc;V。計(jì)算培養(yǎng)基中需要的離子和蛋白質(zhì)的量，且將計(jì)算出的量的離子和蛋白質(zhì)加入培養(yǎng)基中，以在將貼壁細(xì)胞直接重新接種在中空纖維生物反應(yīng)器中使用。附圖說明圖I為在本專利技術(shù)中有用的中空纖維生物反應(yīng)器的示例圖。 圖2示出了可被本專利技術(shù)使用的細(xì)胞擴(kuò)增系統(tǒng)的示例圖。圖3是在根據(jù)本專利技術(shù)完整重新接種的程序之前、過程中及之后的代謝濃度的示圖。具體實(shí)施例方式本申請(qǐng)大體涉及用于收集和/或重新接種來自封閉細(xì)胞擴(kuò)增系統(tǒng)的中空纖維細(xì)胞生長腔體/生物反應(yīng)器的貼壁細(xì)胞(尤其為間充質(zhì)干細(xì)胞)的無菌方法。封閉系統(tǒng)指該系統(tǒng)沒有直接暴露于大氣。從細(xì)胞擴(kuò)增系統(tǒng)收集擴(kuò)增的細(xì)胞包括從生物反應(yīng)器中移除所有擴(kuò)增的細(xì)胞。重新接種收集到的細(xì)胞包括將所有被移除的細(xì)胞重新裝載在相同或不同的生物反應(yīng)器中以用于進(jìn)ー步擴(kuò)增；或，將收集到的細(xì)胞的一部分重新裝載在相同或不同的生物反應(yīng)器中，同時(shí)保留被移除細(xì)胞的剰余部分用于隨后的應(yīng)用。現(xiàn)在參考圖1，在正面立視圖中示出了可被本專利技術(shù)使用的中空纖維細(xì)胞生長腔體100的實(shí)例。細(xì)胞生長腔體100具有縱向軸LA-LA，且包括細(xì)胞生長腔體的殼體104。在至少ー個(gè)實(shí)施方式中，細(xì)胞生長腔體的殼體104包括四個(gè)開孔(opening)或端ロ(port) IC入口 108、IC出口 120、EC入口 128和EC出口 132。應(yīng)注意在附圖中，相同的元件由相同的標(biāo)記表示。箭頭示出了流體流過生物反應(yīng)器100 (圖I)和細(xì)胞擴(kuò)增系統(tǒng)200 (圖2)的方向。多個(gè)中空纖維116被配置在細(xì)胞生長腔體的殼體104內(nèi)。用于制造中空纖維116的材料可以是能夠被制成中空纖維的任何生物相容的聚合材料。術(shù)語“中空纖維”、“中空纖維毛細(xì)管”和“毛細(xì)管”可互換使用。多個(gè)中空纖維被稱為膜。中空纖維116的末端可通過連接材料(本文中還被稱為“灌封料(potting) ”或“灌封材料”)被灌封至細(xì)胞生長腔體的殼體104的末端。灌封料可為用于粘合中空纖維116的任何適當(dāng)?shù)牟牧希珬l件是不阻塞培養(yǎng)基(和如果期望的細(xì)胞)進(jìn)入中空纖維的流動(dòng)。示例性的灌封材料包括(但并不限于)聚氨酯或其它適當(dāng)?shù)恼澈匣蛘掣浇M分。端蓋112和124被分別配置在傳質(zhì)裝置(mass transferdevice)的姆一端。第一循環(huán)路徑202 (見圖2)中的細(xì)胞生長培養(yǎng)基通過在細(xì)胞生長腔體100的第一縱向末端112處的IC入口 108穿入細(xì)胞生長腔體100，進(jìn)入且穿過中空纖維116的毛細(xì)管內(nèi)側(cè)(在各實(shí)施方式中被稱為毛細(xì)管內(nèi)(“1C”)側(cè)或“ IC空間”)，且通過位于細(xì)胞生長腔體100的第二縱向末端124的IC出口 120穿出細(xì)胞生長腔體100。在IC入口 108和IC出ロ 120之間的流體路徑限定了細(xì)胞生長腔體100的IC部分126。第二循環(huán)路徑204(見圖2)中的流體通過EC入口 128流入細(xì)胞生長腔體100，與中空纖維116的毛細(xì)管外側(cè)或外部(被稱為“EC側(cè)”或“ EC空間”)接觸，且經(jīng)由EC出口132離開細(xì)胞生長腔體100。EC入口 128和EC出口 132之間的流體路徑包括細(xì)胞生長腔體100的EC部分136。經(jīng)由EC入口 128進(jìn)入細(xì)胞生長腔體的流體與中空纖維116的外部接觸。小分子(例如離子、水、氧氣、乳酸鹽等)可通過中空纖維從IC空間擴(kuò)散至EC空間，或從EC空間擴(kuò)散至IC空間。大分子量的分子(諸如生長因子)通常太大而不能穿過 中空纖維膜，因此留在中空纖維的IC空間中。可根據(jù)需要替換培養(yǎng)基。培養(yǎng)基還可通過氣 體轉(zhuǎn)移組件/氧合器232進(jìn)行循環(huán)以根據(jù)需要交換氣體。在不背離本專利技術(shù)的精神和范圍的情況下，細(xì)胞通常被容納在第一循環(huán)路徑202中的中空纖維的IC空間內(nèi)，但還可被容納在第二循環(huán)路徑204中的EC空間內(nèi)。不管細(xì)胞生長在IC空間還是生長在EC空間中，細(xì)胞均生長在細(xì)胞生長空間中。用于制造中空纖維膜的材料可為能夠被制成中空纖維的任何生物相容的聚合本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
【技術(shù)特征摘要】
【國外來華專利技術(shù)】...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：格倫·德爾貝特·安特韋勒，大衛(wèi)·A·溫德米勒，莫尼克·吉文斯，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：泰爾茂比司特公司，
類型：
國別省市：
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