本發明專利技術涉及包含生物合成途徑的重組微生物以及使用所述重組微生物產生多種有益代謝產物的方法。在本發明專利技術的多個方面，所述重組微生物可進一步包含一種或多種修飾，導致降低或消除3-酮酸（例如，乙酰乳酸和2-乙酰-2-羥基丁酸）和/或醛衍生的副產物。在本文所述的多個實施方案中，所述重組微生物可以是酵母屬(Saccharomyces)進化枝微生物、Crabtree-陰性酵母微生物、Crabtree-陽性酵母微生物、后-WGD（全基因組倍增）酵母微生物、前-WGD（全基因組倍增）酵母微生物以及非發酵酵母微生物。
【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】
本專利技術提供了重組微生物以及產生此類微生物的方法。還提供了通過使合適的底物與重組微生物和由其得到的酶制劑接觸來產生包括燃料、化學品和氨基酸的有益代謝產物的方法。以電子方式提交的文本文件描述與此以電子方式提交的文本文件的內容全文以引用方式并入本文計算機可讀格式的序列表副本(文件名GEV0_045_03W0_SeqList_ST25. txt，記錄日期2011年2月9日，文件大小306千字節)。
技術介紹
微生物將丙酮酸轉化成有益代謝產物(包括燃料、化學品和氨基酸)的能力近年來已在文獻中得到廣泛描述。參見例如Alper等，2009, Nature Microbiol. Rev. 7:715-723。重組工程技術已使得可以創建表達能夠產生許多有用產物的生物合成途徑的微生物，這些產物例如纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸和泛酸(維生素B5)。此外，已在表達異源代謝途徑的微生物中通過重組方法產生了燃料，諸如異丁醇(參見例如，Donaldson等的W0/2007/050671以及Liao等的W0/2008/098227)。雖然工程化微生物代表了可再生生產燃料、化學品和氨基酸的可能有用的工具，但是其中許多這些微生物不能滿足商業相關要求，原因是它們的性能特征低下，包括低生產率、低滴度和低得率。在許多現有微生物中觀察到的性能欠佳的主要原因之ー是不可取地將途徑中間體轉化成了不需要的副產物。本專利技術人已鑒定出多種副產物，包括2，3-ニ羥基-2-甲基丁酸(DH2MB) (CAS#14868-24-7)、2_ こ基-2，3- ニ羥基丁酸、2，3- ニ羥基-2-甲基-丁酸、異丁酸、3-甲基-1-丁酸、2-甲基-1-丁酸和丙酸，它們衍生自用于產生燃料、化學品和氨基酸的生物合成途徑的多種中間體。這些副產物的蓄積會對多種發酵反應中所期望代謝產物的合成和得率產生負面影響。迄今為止，尚未表征負責產生這些不需要的副產物的酶活性。更具體地講，本申請表明，3-酮酸還原酶(3-KAR)和醛脫氫酶(ALDH)的活性使得由重要的生物合成途徑中間體形成這些副產物。本專利技術由研究這些酶活性而得來，并表明3-KAR和/或ALDH酶的抑制能顯著減少或消除不需要的副產物的形成，并同時提高有益代謝產物的得率和滴度。本申請此外還表明，增強3-KAR和/或ALDH酶活性可用于增加多種副產物的產生，諸如2，3- ニ羥基-2-甲基丁酸(DH2MB)、2-こ基-2，3-ニ羥基丁酸、2，3-ニ羥基-2-甲基-丁酸、異丁酸、3-甲基-I- 丁酸、2-甲基-I- 丁酸和丙酸。專利技術概述 本專利技術人已發現，不需要的副產物可在多個發酵過程中蓄積，包括候選生物燃料-異丙醇的發酵。這些不需要的副產物的蓄積因途徑中間體的不可取轉化所致，這些中間體包括3-酮酸、こ酰乳酸和2-こ酰-2-羥基丁酸和/或酸，諸如異丁醛、I- 丁醛、I-丙醛、2-甲基-1-丁醛和3-甲基-1-丁醛。這些中間體向不需要的副產物的轉化會抑制3-酮酸-和/或醛衍生產物的最佳的生產率和得率。因此，本專利技術人已開發了在3-酮酸和/或醛作為途徑中間體的過程中減少3-酮酸和/或醛中間體向各種發酵副產物轉化的方法。在第一方面，本專利技術涉及重組微生物，其包含3-酮酸和/或醛為其中間體的生物合成途徑，其中所述重組微生物(a)基本上不含催化3-酮酸向3-羥基酸轉化的酶；(b)基本上不含催化醛向酸副產物轉化的酶；(c)被工程化以降低或消除催化3-酮酸向3-羥基酸轉化的酶的表達或活性；和/或(d)被工程化以降低或消除催化醛向酸副產物轉化的酶的表達或活性。在一個實施方案中，3-酮酸為こ酰乳酸。在另ー個實施方案中，3-酮酸為2-こ酰-2-羥基丁酸。在一個實施方案中，本專利技術涉及重組微生物，其包含使用3-酮酸(こ酰乳酸)作為中間體的生物合成途徑，其中所述重組微生物被工程化以降低或消除催化こ酰乳酸向相應的3-羥基酸(DH2MB)轉化的酶的表達或活性。在一些實施方案中，催化こ酰乳酸向DH2MB轉化的酶為3-酮酸還原酶(3-KAR)。在一個實施方案中，本專利技術涉及重組微生物，其包含使用3-酮酸(2-こ酰-2-羥基丁酸)作為中間體的生物合成途徑，其中所述重組微生物被工程化以降低或消除催化こ酰乳酸向相應3-羥基酸(2-こ基-2，3- ニ羥基丁酸)轉化的酶的表達或活性。在一些實施方案中，催化2-こ酰-2-羥基丁酸向2-こ基-2，3- ニ羥基丁酸轉化的酶為3-酮酸還原酶(3-KAR)。在一個實施方案中，本專利技術涉及重組微生物，其包含使用醛作為中間體的生物合成途徑，其中所述重組微生物被工程化以降低或消除催化醛向酸副產物轉化的酶的表達或活性。在一些實施方案中，催化醛向酸副產物轉化的酶為醛脫氫酶(ALDH)。在一個實施方案中，本專利技術涉及重組微生物，其包含使用3-酮酸和醛兩者作為中間體的生物合成途徑，其中所述重組微生物(a)被工程化以降低或消除催化3-酮酸中間體向3-羥基酸副產物轉化的酶的表達或活性；以及(b)被工程化以降低或消除催化醛中間體向酸副產物轉化的酶的表達或活性。在一個實施方案中，3-酮酸為こ酰乳酸，而3-羥基酸副產物為DH2MB。在另ー個實施方案中，3-酮酸為2-こ酰-2-羥基丁酸，而3-羥基酸副產物為2-こ基-2，3- ニ羥基丁酸。在一些實施方案中，催化こ酰乳酸向DH2MB轉化的酶為3-酮酸還原酶(3-KAR)。在一些其它實施方案中，催化2-こ酰-2-羥基丁酸向2-こ基-2，3-ニ羥基丁酸轉化的酶為3-酮酸還原酶(3-KAR)。在一些其它實施方案中，催化醛向酸副產物轉化的酶為醛脫氫酶(ALDH)。在另ー些其它實施方案中，催化こ酰乳酸向DH2MB轉化的酶為3-酮酸還原酶(3-KAR)，而催化醛向酸副產物轉化的酶為醛脫氫酶(ALDH)。在另ー些其它實施方案中，催化2-こ酰-2-羥基丁酸向2-こ基-2，3- ニ羥基丁酸轉化的酶為3-酮酸還原酶(3-KAR)，而催化醛向酸副產物轉化的酶為醛脫氫酶(ALDH)。在本文所述的多個實施方案中，本專利技術的重組微生物可包括降低或缺失催化3_酮酸中間體向3-羥基酸副產物轉化中涉及到的一種或多種內源性蛋白質的活性或表達。在一個實施方案中，催化3-酮酸中間體向3-羥基酸副產物轉化中涉及到的一種或多種內源性蛋白質的活性或表達被降低至少約50%。在另ー個實施方案中，所述催化3-酮酸中間體向3-羥基酸副產物轉化中涉及到的一種或多種內源性蛋白質的活性或表達與不包括降低或缺失催化3-酮酸中間體向3-羥基酸副產物轉化中涉及到的ー種或多種內源性蛋白質的活性或表達的重組微生物相比，被降低至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%或至少約99%。在一個實施方案中，3_酮酸中間體為こ酰乳酸，而3-羥基酸副產物為DH2MB。在另ー個實施方案中，3-酮酸中間體為2-こ酰-2-羥基丁酸，而3-羥基酸副產物為2-こ基-2，3- ニ羥基丁酸。 在本文所述的多個實施方案中，催化3-酮酸中間體向3-羥基酸副產物轉化中涉及到的蛋白質為酮還原酶。在示例性實施方案中，酮還原酶為3-酮酸還原酶(3-KAR)。在另ー個實施方案中，該蛋白質為短鏈醇脫氫酶。在又一個實施方案中，該蛋白質為中鏈醇脫氫酶。在又一個實施方案中本文檔來自技高網...
【技術保護點】
【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】...
【專利技術屬性】
技術研發人員：K埃文斯，J凱利，S巴斯琴，F阿諾德，T比爾特，A霍金斯，S波特沙因曼，P邁恩霍爾德，CA鄧頓，A阿利斯蒂多，J烏拉諾，D萊斯，M彼得斯，M戴伊，J簡考斯卡斯，R貝里，
申請(專利權)人：格沃股份有限公司，加州理工學院，
類型：
國別省市：
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