產琥珀酸放線桿菌菌株及其篩選和發酵生產丁二酸的方法技術

本發明專利技術公開了一種產琥珀酸放線桿菌（Actinobacillus?succinogenes）GXAS-137，以及其篩選和發酵生產丁二酸的方法，該菌株從牛瘤胃富集、篩選獲得，并利用該產琥珀酸放線桿菌菌株接入種子培養基中，在厭氧培養箱或普通培養箱中30-38℃靜止培養24-36h，按1-10%的接種量接入發酵培養基中，調節pH在6.0-7.0，并在30-38℃發酵24-120h，即可得到丁二酸。并對不同原料和培養基中進行發酵研究，丁二酸產量能達到70g/L，具有工業化生產的潛力。

【技術實現步驟摘要】
產琥珀酸放線桿菌菌株及其篩選和發酵生產丁二酸的方法
本專利技術涉及生物工程
，特別涉及一種產琥珀酸放線桿菌菌株的篩選及其應用。
技術介紹
丁二酸，又稱琥珀酸（succsinicacid），是一種常見的天然有機酸，廣泛存在于動、植物和微生物體內，是生物進行TCA循環的中間產物之一。它是一種重要的有機合成中間體，主要應用于食品、醫藥、生物降解塑料、表面活性劑、洗滌劑、和綠色溶劑等領域。此外，丁二酸還可以用作動物飼料添加劑和植物生長刺激劑等方面。目前，丁二酸生產主要是利用化學合成的方法，從丁烷通過順式丁烯二酐生產丁二酸，主要由石蠟氧化法、輕油氧化法、丁烷氧化法、丁二腈水解法、催化加氫等方法。以化學方法生產丁二酸，需要消耗大量不可再生的石化原料，生產成本高，環境污染嚴重，從而限制了丁二酸的廣泛應用。因此，人們開始將目標轉向通過生物發酵法來生產丁二酸。與傳統的化學合成法相比，發酵法具有成本低、環境效益好等優點。目前，通過發酵法生產得到的丁二酸，其價格大約為0.55～1.1﹩/kg。另外，據Bio-amber公司稱，丁二酸具有25億歐元的市場，且生物法生產丁二酸能夠與石化的方法相競爭，并計劃于2011前利用植物作為原料進行工業生產丁二酸。丁二酸是許多嚴格厭氧菌和兼性厭氧菌代謝的重要中間產物。目前人們已經發現多種微生物可以通過發酵來生產丁二酸，其中研究主要集中在大腸桿菌（E.coli），曼海姆產琥珀酸菌(Mannheimiasucciniciproducens)，產琥珀酸厭氧螺菌(Anaerobiospirillumsucciniciproducens)和產琥珀酸放線桿菌（Actinobacillussuccinogenes）。此外，一些乳酸菌、丙酸產生菌及真菌等也可以產生少量丁二酸。在眾多的產丁二酸微生物中，瘤胃微生物產琥珀酸放線桿菌能夠利用多種糖類進行發酵，并且可以耐受葡萄糖和丁二酸的濃度分別高達158g/L和104g/L；同時，該菌以其高產量、高耐受性等優勢，成為最具發展前景的丁二酸產生菌之一。國外在產琥珀酸放線桿菌發酵生產丁二酸研究方面研究較多，其中美國密歇根生物技術研究院（MEI）Zeikus等人課題組處于領先地位。他們在1996年篩選出一株高產丁二酸菌株130Z（ActinoabcillussuccinogensATCC55618），并以130Z為出發菌株，篩選出對單氟乙酸抗性的自發突變株。在最適條件下，此抗性株發酵時間48h，發酵產物中的丁二酸/乙酸比例高達85:1；丁二酸/甲酸比例高達160:1，丁二酸產量可以達到80-110g/L，得率高達97%，使丁二酸發酵獲得了突破性進展（AppliedandEnvironmentalMicrobiology.2005,71:6651-6656；IntJSystBacteriol1999，49：207-216）。國內對產琥珀酸放線桿菌發酵產丁二酸的研究也較多。較早的有天津大學的趙學明等人對購自國外的ATCC55618菌株發酵研究發現其琥珀酸產量在11.49g/L，并有乳酸等副產物存在，對該菌株誘變后產量亦無顯著提高。近期，江南大學的孫志浩等人，篩選出菌株ActinobacillussuccinogensCGMCC1593，對其誘變選育后，SF-9在5L發酵罐上發酵36h丁二酸產量達40.51g/L，但仍然存在乳酸、甲酸和乙酸等副產物。南京工業大學姜岷等通過對篩選得到的產琥珀酸放線桿菌ActinobacillussuccinogenesNJ113(CGMCCNO.1716)進行改造和發酵條件優化，丁二酸的產量可達的52g/L。中國專利文獻：產琥珀酸放線桿菌菌種改組、選育方法以及用其發酵生產丁二酸的方法，申請號：CN200810146688，申請日：2008-09-05，專利技術人：孫志浩；倪曄；鄭璞；董晉軍；專利權人：江南大學。該專利技術涉及一株具有較強鈉離子耐受性和產酸性能的產琥珀酸放線桿菌ActinobacillussuccinogenesCGMCC2653(即F3-10)，該菌株的選育方法及用其發酵生產丁二酸的方法。以產琥珀酸放線桿菌CGMCC1593作為出發菌株，分別對其進行X-射線、紫外線誘變和硫酸二乙酯(EMS)、亞硝基胍(NTG)化學誘變，篩選得到具有改良的發酵產酸性能，特別是鈉離子耐受性有改良三株菌株X-8、UV-17、SE-6，和具有氟乙酸抗性的高產菌株SF-9，將它們用基因組改組方法選育得到高產、耐鈉、抗氟乙酸的菌株F3-10。該菌株F3-10以甘蔗糖蜜為原料，采用Na2CO3控制發酵pH，在5L發酵罐中進行補料分批發酵，48h產丁二酸53.96g/L，對消耗糖產率89.2％，糖利用率94.0％，丁二酸比雜酸為6.58∶1，較出發菌CGMCC1593有顯著提高。綜上所述，目前由于國外的技術封鎖，國外的菌種難以獲得，即使購買到國外菌種，也會由于具體技術條件難以得知，產量也不高，根本達不到文獻報道的產量；國內丁二酸菌株生產方面與國外還有一定的差距，目前國內最高產的也就是50g/L左右的丁二酸。因此，篩選丁二酸更高產的微生物菌株和研究出一種能夠生產更高濃度丁二酸的方法是很有必要的。
技術實現思路
本專利技術的目的就是針對國內生產丁二酸菌株產量不高的現狀，提供一種丁二酸產量能達到70g/L的產琥珀酸放線桿菌，以及其篩選和生產丁二酸的方法。本專利技術是這樣實現的：一株產琥珀酸放線桿菌Actinobacillussuccinogenes菌株，分類屬巴斯德菌科（pasteurellaceae）放線桿菌屬（Actinobacillus）的產琥珀酸放線桿菌（Actinobacillussuccinogenes）GXAS-137，已保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏地址為中國武漢武漢大學郵編430072，保藏時間保存編號為CCTCCNO:M2011399，保藏時間為2011年11月18日，并于2011年11月25日檢測結果為存活。以上所述的產琥珀酸放線桿菌菌株的篩選方法，根據產丁二酸菌株能夠利用富馬酸產生丁二酸的特點，設計以富馬酸鈉為唯一碳源富集培養基和選擇平板，此外通過添加莫能菌素可有效抑制產乳酸菌和產甲烷菌等雜菌生長，在篩選平板中添加適量的丁二酸鈉，可以抑制提高篩選菌株對丁二酸的耐受性，可以有效篩選產琥珀酸放線桿菌菌株，具體步驟如下：（1）將新鮮牛的瘤胃內容物懸浮于適量生理鹽水中，用無菌紗布過濾去除粗纖維等固體物質；（2）將過濾得到的懸浮液接種于50-150ml富集培養基的250ml三角瓶中，30-37℃厭氧箱中培養16-30h；所述的富集培養基為含有富馬酸鹽作為唯一碳源并添加氮源、無機鹽和莫能菌素的培養基，詳細配方如下：富馬酸鈉10-30g/L，酵母粉5-20g/L，蛋白胨5-20g/L，K2HPO41-5g/L，CaCl20.1-1g/L，NaCl0.5-2g/L，(NH4)2SO40.5-2g/L，MgCl20.1-1g/L，莫能菌素0.1-0.2g/L，將前述原料混勻即可得到富集培養基。（3）轉接2次后，培養物按照梯度稀釋后，涂布在篩選培養基的平板上，于厭氧箱培養30-48h，挑選菌落較大菌株于發酵培養基中，培養結束后，HPLC測定每個樣品丁二酸含量，選本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種發酵產丁二酸的微生物菌株，其分類屬巴斯德菌科（pasteurellaceae）放線桿菌屬（Actinobacillus）的產琥珀酸放線桿菌（Actinobacillus？succinogenes）GXAS？137，已保藏于中國典型培養物保藏中心，保存編號為CCTCC？M？2011399。

【技術特征摘要】
1.一種發酵產丁二酸的微生物菌株，其分類屬巴斯德菌科（pasteurellaceae）放線桿菌屬（Actinobacillus）的產琥珀放線桿菌GXAS-137（ActinobacillussuccinogenesGXAS-137），已保藏于中國典型培養物保藏中心，保存編號為CCTCCNO:M2011399。2.一種運用權利要求1所述產琥珀放線桿菌菌株發酵生產丁二酸的方法，其特征在于：將產琥珀放線桿菌菌株接入種子培養基中，在厭氧培養箱或普通培養箱中30-38℃靜止培養24-36h，按1-10%的接種量接入發酵培養基中，調節pH在6.0-7.0，并在30-38℃發酵24-70h，即可產生丁二酸，所述的pH調節劑是碳酸鹽、氨水、NaOH，所述的碳酸鹽為堿式碳酸鎂，所述發酵的條件為有氧或通入N2或CO2。3.根據權利要求2所述產琥珀放線桿菌菌株發酵產丁二酸的方法，其特征在于：所述的種子培養基的成分及其濃度為：糖類10-20g/L，酵母粉5-10g/L，蛋白胨5-10g/L，K2H...

【專利技術屬性】
技術研發人員：申乃坤，黃日波，王青艷，秦艷，黎貞崇，朱婧，王成華，廖思明，
申請(專利權)人：廣西科學院，
類型：發明
國別省市：