本發(fā)明專利技術(shù)公開了一株微嗜酸寡養(yǎng)單胞菌及其在防治蘋果樹腐爛病的生防制劑中的應(yīng)用，屬于植物病害生物防治技術(shù)領(lǐng)域。從山東棲霞商品蘋果園根際土壤中篩選到一株用于蘋果真菌病害生物防治的菌株-微嗜酸寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonas?acidaminiphila)BJ1菌株，保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為：CCTCC?NO：M?2011475。本發(fā)明專利技術(shù)所述的微生物菌劑，制備方法如下：1)培養(yǎng)基的制備，2)BJ1菌株的活化，3)BJ1菌株的液體培養(yǎng)，4)BJ1生防制劑的制備，5)稀釋。本發(fā)明專利技術(shù)微嗜酸寡養(yǎng)單胞菌BJ1菌株對蘋果樹腐爛病有顯著的防治效果，防治效果穩(wěn)定，對環(huán)境友好，大規(guī)模生產(chǎn)的發(fā)酵工藝簡單、生產(chǎn)成本低廉。
【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)屬于植物病害生物防治
，具體地說，本專利技術(shù)涉及一種用于蘋果樹腐爛病菌生物防治的細菌的分類鑒定、發(fā)酵液的制備方法及對蘋果樹腐爛病的防治。
技術(shù)介紹
蘋果是我國的重要經(jīng)濟作物和出口水果，栽培面積和產(chǎn)量均居世界首位。然而，病害卻嚴重制約著我國蘋果產(chǎn)業(yè)的發(fā)展,特別是蘋果樹腐爛病(Valsa ceratosperma)在我國分布廣、危害重、防治難，果農(nóng)稱之為蘋果樹“癌癥”。腐爛病菌具有潛伏侵染特性，一旦條件適宜染病部位樹皮迅速腐爛壞死、樹勢衰退、降低蘋果產(chǎn)量和品質(zhì)，嚴重時可引起主干及整樹死亡，甚至造成毀園(陳策，2009 ;陳策等，1987)。自1916年蘋果樹腐爛病在遼寧省南部地區(qū)發(fā)現(xiàn)以來，該病已在我國有過幾次大流行，造成大面積果樹死亡。隨著我國蘋果產(chǎn)業(yè)種植結(jié)構(gòu)的調(diào)整，現(xiàn)在主栽的蘋果品種幾乎均對腐爛病菌敏感。2008年，國家蘋果產(chǎn)業(yè)技術(shù)體 系調(diào)查顯示，全國范圍內(nèi)蘋果腐爛病的總體發(fā)生率高達52. 7% ;2011年，對棲霞等地腐爛病的發(fā)生嚴重程度進行了調(diào)查，結(jié)果表明，所調(diào)查果園具有新病疤的病株率為68. 20%，死株率為2. 76%，總體發(fā)病情況比一般年份嚴重(曹克強等，2009 ;王彩霞等，2012)。蘋果是多年生木本植物，難以通過栽培坑病品種解決病害問題，且蘋果樹腐爛病具有逐年累積，連續(xù)危害的特點。目前，對于蘋果樹腐爛病等病害的防控主要依靠化學藥齊U，因此，蘋果果園用藥量比大田作物要高出幾倍到十幾倍。長期大量使用化學農(nóng)藥不僅會嚴重污染環(huán)境，造成對非靶標生物的有害影響，使果園生態(tài)環(huán)境惡化，同時也會增加腐爛病菌的突變幾率，導致抗、耐藥性菌株的大量增加。因此，尋找新的、安全有效的措施來防治蘋果樹腐爛病顯得尤為迫切和重要。利用生防菌防治植物病害在國內(nèi)外均有相關(guān)報道，經(jīng)檢索，申請者在現(xiàn)有的專利和非專利文獻中沒有檢索到微嗜酸寡養(yǎng)單胞菌用于蘋果樹腐爛病生物防治的相關(guān)文獻報道和專利。
技術(shù)實現(xiàn)思路
本專利技術(shù)要解決的技術(shù)問題是提供一種針對由黑腐皮殼菌(Valsa ceratosperma)引起的蘋果樹腐爛病具有顯著生物防治效果的微嗜酸寡養(yǎng)單胞菌菌株；將其制備為生防菌齊U，用來防治蘋果樹腐爛病。以此減少化學藥劑的使用次數(shù)和使用量，消弱其對環(huán)境的破壞以及對人類身體健康的影響，并可延遲蘋果樹腐爛病菌抗、耐藥菌株的出現(xiàn)，以實現(xiàn)蘋果產(chǎn)業(yè)向著安全、高效、可持續(xù)的方向發(fā)展。本專利技術(shù)通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)本專利技術(shù)從山東省蘋果主產(chǎn)區(qū)棲霞市商品蘋果園的根際土壤中分離篩選獲得一株用于蘋果樹腐爛病生物防治的細菌菌株BJl，經(jīng)形態(tài)學、生理生化特性及16S rDNA序列分析鑒定為微嗜酸寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonas acidaminiphila),該菌株已于2011年12月23日送交湖北省武漢市武漢大學內(nèi)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心(英文簡稱CCTCC)，其保藏號為CCTCC NO M2011475o申請人:利用液體發(fā)酵的方法制備了一種對蘋果樹腐爛病具有防治作用的微生物菌劑，其步驟如下I)培養(yǎng)基的制備NA培養(yǎng)基蛋白胨10. 0g，牛肉膏3. 0g，NaCl 5. 0g，瓊脂粉15. 0g，加水定容至IOOOmL, pH 值 7. 0,121°C高壓蒸汽滅菌 20min ；NB培養(yǎng)基蛋白胨10. 0g，牛肉膏3. 0g，NaCl 5. 0g，加水定容至lOOOmL，pH值7. 0，分裝于250mL三角瓶中，裝瓶量為80mL，121 °C高壓蒸汽滅菌20min ； 2) BJl菌株的活化先將保存的生防菌微嗜酸寡養(yǎng)單胞菌BJl接種在上述NA培養(yǎng) 基中，于30°C恒溫培養(yǎng)箱中活化24h ；3) BJl菌株的液體培養(yǎng)挑取步驟2)中活化的微嗜酸寡養(yǎng)單胞菌BJl菌株的單菌落，接種于裝瓶量為80mL/250mL的NB培養(yǎng)基中，180r. min—1，30°C恒溫振蕩培養(yǎng)48h，得到濃度為IO7Cfu. ml/1的BJl菌株的細胞培養(yǎng)液；4)BJ1生防制劑的制備將步驟3)中制備的細胞培養(yǎng)液，在4°C條件下，12000r.rniiT1離心20min，收集上清液經(jīng)0. 22 μ m微孔濾膜過濾，上清液即為無菌發(fā)酵濾液；5)稀釋將步驟4)中制備的無菌發(fā)酵濾液稀釋0-100倍。本專利技術(shù)的有益效果是I.本專利技術(shù)微嗜酸寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonas acidaminiphila)BJl菌株對蘋果樹腐爛病有顯著的防治效果，實施例的研究表明，本專利技術(shù)的生防菌株在蘋果離體枝條防效試驗中，發(fā)酵濾液對蘋果樹腐爛病的防效可達到94. 97%，在2 3年生蘋果幼樹防效試驗中，發(fā)酵濾液的防效也達70%以上,與化學藥劑10%苯醚甲環(huán)唑Difenoconazole (世高)可濕性粉劑防效相當；2.本專利技術(shù)所提供的微嗜酸寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonas acidaminiphila)BJl菌劑防治效果穩(wěn)定，對環(huán)境友好，大規(guī)模生產(chǎn)的發(fā)酵工藝簡單、生產(chǎn)成本低廉。附圖說明圖I :微嗜酸寡養(yǎng)單胞菌BJl菌株16S rDNA基因PCR擴增示意中M為核酸Marker，1-3分別為BJl菌株基因組DNA稀釋10、50和100倍的擴增結(jié)果圖2 :微嗜酸寡養(yǎng)單胞菌BJl菌株發(fā)酵濾液對蘋果樹腐爛病菌分生孢子萌發(fā)的影響；圖中A為25°C保濕36h腐爛病菌分生孢子對照萌發(fā)情況；B_E為菌株BJl發(fā)酵濾液處理后保濕36h腐爛病菌分生孢子萌發(fā)受抑制情況圖3 :微嗜酸寡養(yǎng)單胞菌BJl菌株發(fā)酵濾液對蘋果樹腐爛病菌菌絲形態(tài)的影響圖中A為蘋果樹腐爛病菌的正常菌絲；B_C為腐爛病菌與BJl菌株對峙培養(yǎng)5d后的畸形菌絲本專利技術(shù)菌體的保藏信息如下保藏單位中國典型培養(yǎng)物保藏中心(英文簡稱CCTCC)地址中國·武漢·武漢大學保藏日期2011年12月23日保藏編號CCTCCNO M2011475具體實施技術(shù)以下實施例僅用于對本專利技術(shù)做進一步的描述，并不是用來限制本專利技術(shù)的范圍。實施例I生防菌BJl菌株的篩選從山東省蘋果主產(chǎn)區(qū)棲霞市商品蘋果果園園的根際土壤中分離到63株細菌，利用傳統(tǒng)的平板對峙培養(yǎng)法進行初篩，后將得到的初篩菌株在NB培養(yǎng)基中進行液體發(fā)酵，利用發(fā)酵濾液進行復(fù)篩，最后得到對蘋果樹腐爛病菌具有顯著拮抗作用的菌株BJl (結(jié)果見表I)。 所用固體平板為PDA培養(yǎng)基，其組分及配方如下馬鈴薯削皮后稱取200g，切成小塊在水中煮沸15 20min，四層紗布過濾后加入葡萄糖20g，瓊脂粉15g，定容至lOOOmL，pH值天然，在121°C高壓蒸汽滅菌20min。生防菌BJl菌株的鑒定(I)形態(tài)特征BJ1菌株在NA培養(yǎng)基(配方蛋白胨lO.Og，牛肉膏3. 0g，NaCl5.0g，瓊脂粉15. 0g，加水定容至IOOOmL,天然pH值，121°C高壓蒸汽滅菌20min)上菌落不規(guī)則、黃色、中央略突起、不透明、鏡檢為桿狀(0. 4μ -0. 5μπ Χ0. 2μ -0. 3μ )、不產(chǎn)芽孢、革蘭氏染色陰性。BJl菌株的保存方法按周德慶主編，《微生物學實驗技術(shù)手冊》，上海科學技術(shù)出版社，1986版介紹的方案進行操作。(2)生理生化特性測定方法參閱東秀珠和蔡妙英的《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》進行，BJl菌株不形成H2S和吲哚，接觸酶陽性，氧化酶陰性，硝酸鹽還原陰性，明膠水解陽性，淀粉水解陰性，檸檬酸鹽利用陰性；可利用葡萄糖，本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護點】
一株微嗜酸寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonas？acidaminiphila)BJ1，于2011年12月23日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(英文簡稱CCTCC)，保藏編號為CCTCC？NO：M2011475。
【技術(shù)特征摘要】
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：王彩霞，李保華，李桂舫，董向麗，張清明，
申請(專利權(quán))人：王彩霞，
類型：發(fā)明
國別省市：
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