拉帕醇在制備抗HIV-1病毒的藥物中的應(yīng)用制造技術(shù)

本發(fā)明專(zhuān)利技術(shù)涉及拉帕醇在制備抗HIV-1病毒的藥物中的應(yīng)用。所述的藥物能夠抑制HIV-1輔助蛋白Vpu降解宿主限制因子BST-2，提高細(xì)胞表面BST-2含量，從而抑制HIV-1病毒釋放。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專(zhuān)利技術(shù)屬于醫(yī)藥生物領(lǐng)域，具體涉及拉帕醇在制備抗Hiv-I病毒的藥物中的應(yīng)用。
技術(shù)介紹
病毒的耐藥性是目前艾滋病藥物治療中最亟需解決的問(wèn)題。耐藥是病毒的藥物作用靶位蛋白變異的結(jié)果。因?yàn)槟退幹杲?jīng)常對(duì)一組抗病毒藥物耐藥，并且同一類(lèi)藥物之間交叉耐藥非常常見(jiàn)。HIV-I之所以能夠迅速產(chǎn)生針對(duì)現(xiàn)有臨床應(yīng)用的抗病毒藥物的耐藥性，其主要根源在于這些藥物所針對(duì)的靶點(diǎn)都是病毒本身。而病原病毒天然就具有高變異的特點(diǎn)，在藥物的選擇壓力下，很容易引起病毒的迅速變異從而產(chǎn)生耐藥。因此，解決HIV-I的 耐藥性問(wèn)題的關(guān)鍵之一在于必須突破傳統(tǒng)的“以病原病毒本身為靶”的藥物發(fā)展模式。在生物進(jìn)化的漫長(zhǎng)過(guò)程中，宿主細(xì)胞會(huì)形成針對(duì)不同病原病毒的防御體系，而病毒也會(huì)形成特異性的拮抗機(jī)制，以逃避宿主細(xì)胞的抑制作用。最近研究發(fā)現(xiàn)，宿主限制因子BST-2(也命名為T(mén)etherin/HMl. 24/CD317)可抑制包括HIV-I在內(nèi)的多種包膜病毒的釋放。BST-2屬I(mǎi)I型整合膜蛋白，整個(gè)蛋白為同源二聚體，異源糖基化，大小為30-36kDa。BST-2在多種細(xì)胞中均有表達(dá)，包括末端分化B細(xì)胞、骨髓基質(zhì)細(xì)胞、激活的T細(xì)胞和樹(shù)突狀漿細(xì)胞、Hela細(xì)胞，并且干擾素誘導(dǎo)可顯著增強(qiáng)表達(dá)水平。BST-2將新生的成熟HIV-I病毒顆粒束縛在細(xì)胞膜表面，阻止其釋放。束縛的病毒顆粒被內(nèi)吞到細(xì)胞的⑶63內(nèi)體結(jié)構(gòu)(Q)63_positive endosomal compartments)中降解。研究表明，BST-2不僅可以阻止游離病毒顆粒的釋放，而且可以抑制HIV-I病毒顆粒的主要傳播方式一細(xì)胞間擴(kuò)散。HIV-I通過(guò)其編碼的輔助蛋白Vpu來(lái)拮抗BST-2的抑制作用。Vpu通過(guò)其跨膜區(qū)同BST-2跨膜區(qū)相互作用，下調(diào)膜表面BST-2，使BST-2遠(yuǎn)離其作用位點(diǎn)，并且通過(guò)溶酶體途徑降解BST-2，從而提高病毒釋放。如能阻止Vpu降解BST-2，提高細(xì)胞表面BST-2含量，則可以抑制病毒釋放，從而達(dá)到抗病毒效果。化合物拉帕醇(LapachoI, CAS號(hào):84-79-7)是一種萘醌，最早由E. Paterno在1882年從紫薇科(Bignoniaceae)的褐色鐘花樹(shù)(Tabebuia avel Ianedae)中分離得到。Lapachol在自然界中分布廣泛，不僅存在于紫薇科的多個(gè)種屬中，在馬鞭草科(Verbenaceae)、山龍眼科(Proteaceae)、 科(Leguminosae)、山攬科(Sapotaceae)、玄參科(Scrophulariaceae)和錦葵科(Malvaceae)中均有發(fā)現(xiàn)。從發(fā)現(xiàn)至今的一百多年里，Lapachol及其衍生物得到了大量的研究。研究表明，Lapachol具有多種生物學(xué)活性，比如抗腫瘤、消炎、抗寄生蟲(chóng)、抗利什曼原蟲(chóng)、殺滅釘螺、抗細(xì)菌、抗真菌、抗病毒等。現(xiàn)有技術(shù)中，未見(jiàn)化合物拉帕醇在制備抗HIV-I病毒的藥物方面的報(bào)道。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本專(zhuān)利技術(shù)的目的是提供拉帕醇在制備抗HIV-I病毒的藥物方面的新用途。本專(zhuān)利技術(shù)提供拉帕醇在制備抗HIV-I病毒的藥物中的應(yīng)用。優(yōu)選地，所述的藥物為HIV-I的輔助蛋白Vpu降解宿主限制因子BST-2的抑制劑。優(yōu)選地，所述的藥物為提高細(xì)胞表面BST-2含量的藥物。更優(yōu)選地，所述的藥物為抑制HIV-I病毒釋放的藥物。由于拉帕醇能夠抵抗HIV-I病毒，因此能夠?qū)⒗链甲鳛橛行С煞种苽淇笻IV-I病毒的藥物。本專(zhuān)利技術(shù)還公開(kāi)拉帕醇作為HIV-I的輔助蛋白Vpu降解宿主限制因子BST-2的抑制劑的應(yīng)用。本專(zhuān)利技術(shù)人經(jīng)研究意外地發(fā)現(xiàn)，拉帕醇能抑制HIV-I的輔助蛋白Vpu對(duì)宿主限制因子BST-2的降解，因此拉帕醇能作為HIV-I的輔助蛋白Vpu降解宿主限制因子BST-2的·抑制劑。本專(zhuān)利技術(shù)還公開(kāi)拉帕醇在抑制HIV-I的輔助蛋白Vpu降解宿主限制因子BST-2中的應(yīng)用。拉帕醇能抑制HIV-I的輔助蛋白Vpu對(duì)宿主限制因子BST-2的降解。本專(zhuān)利技術(shù)還公開(kāi)拉帕醇在提高細(xì)胞表面BST-2含量中的應(yīng)用。拉帕醇能提高細(xì)胞表面BST-2含量。本專(zhuān)利技術(shù)還公開(kāi)拉帕醇在抑制HIV-I病毒釋放中的應(yīng)用。拉帕醇能抑制HIV-I病毒釋放。本專(zhuān)利技術(shù)人發(fā)現(xiàn)了化合物拉帕醇的新活性。拉帕醇能夠抑制HIV-I的輔助蛋白Vpu降解宿主限制因子BST-2，提高細(xì)胞表面宿主限制因子BST-2的含量，從而抑制HIV-I病毒釋放，達(dá)到抗HIV-I病毒的效果。因此該化合物作為HIV-I的輔助蛋白Vpu降解宿主限制因子BST-2的抑制劑，能用于抗HIV-I病毒。本專(zhuān)利技術(shù)突破了傳統(tǒng)的“以病原病毒本身為靶”的藥物發(fā)展模式，解決了 HIV-I的耐藥性問(wèn)題。附圖說(shuō)明圖I示出Cell-ELISA方法檢測(cè)拉帕醇對(duì)細(xì)胞膜表面BST-2表達(dá)水平的影響；圖2示出流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)拉帕醇對(duì)細(xì)胞膜表面BST-2表達(dá)水平的影響；圖3示出化合物拉帕醇對(duì)BST_2mRNA轉(zhuǎn)錄的影響；圖4示出化合物拉帕醇對(duì)Hela-Vpu細(xì)胞中Vpu表達(dá)的影響；圖5示出化合物拉帕醇對(duì)HIV病毒顆粒釋放的影響；圖6示出化合物拉帕醇對(duì)病毒感染性的測(cè)試結(jié)果；圖7示出化合物拉帕醇對(duì)IFNα誘導(dǎo)的IFNARl降解的影響；圖8示出化合物拉帕醇對(duì)于Vpu、BST_2和β _TrCP2三者復(fù)合物相互作用的影響；圖9示出化合物拉帕醇對(duì)于BST-2在細(xì)胞內(nèi)分布影響；圖10示出化合物拉帕醇抗HIV-I活性的IC5tl。具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于說(shuō)明本專(zhuān)利技術(shù)，但不用來(lái)限制本專(zhuān)利技術(shù)的范圍。 實(shí)施例I化合物拉帕醇抑制Vpu下調(diào)細(xì)胞表面的BST-2穩(wěn)定表達(dá)Vpu蛋白的Hela-Vpu細(xì)胞為岑山等(岑山等。篩選拮抗Vpu降解BST-2活性的抗病毒藥物的方法。專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?01010123002. I)構(gòu)建篩選得到，其表面BST-2被Vpu下調(diào),較正常Hela低。將He I a細(xì)胞和He I a_Vpu細(xì)胞接種于96孔板中，每孔細(xì)胞為I.0X104個(gè)。在37 °C、5%C02孵箱中培養(yǎng)24h后，分別加入二甲基亞砜(DMS0)、拉帕醇處理，繼續(xù)培養(yǎng)24h后，采用Cell-ELISA的方法檢測(cè)細(xì)胞膜表面BST-2的表達(dá)水平。檢測(cè)過(guò)程為吸去舊培養(yǎng)基，PBS洗兩次，每次2min。每孔加入100 μ 14%多聚甲醛，室溫固定20min。棄去，加入150 μ I PBS洗三次，每次lmin。每孔加入50 μ 12%BSA配制的BST-2抗體，濃度為I :5000，37°C培養(yǎng)lh。PBS洗四次,每次l_2min。每孔加入50μ 12%BSA配制的HRP驢抗兔(donkey anti-rabbit)抗體，濃度為I :6000，室溫培養(yǎng)40min。PBS洗四次，每次l_2min。每孔加入100 μ ITMB顯色液(現(xiàn)配現(xiàn)用)，避光反應(yīng)30min。每孔加入50 μ 10. 5Μ H2SO4或者IM HCl終止反應(yīng)，立即于450nm處測(cè)定吸光值。結(jié)果如圖I所示，5 μ M拉帕醇可以提高50%Hela_Vpu細(xì)胞表面BST-2水平，而對(duì)正常Hela細(xì)胞表面BST-2水平?jīng)]有明顯的提高。本專(zhuān)利技術(shù)人采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)方法,進(jìn)一步確證化合物拉帕醇對(duì)Hela-Vpu細(xì)胞表面BST-2水平的影響。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)方法如下將Hela-Vpu細(xì)胞接種于6孔板中，每孔細(xì)胞為2. O 本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
拉帕醇在制備抗HIV？1病毒的藥物中的應(yīng)用。

【技術(shù)特征摘要】
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【專(zhuān)利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：岑山，張全，米澤云，李曉宇，周金明，殷霄，馬鈴，
申請(qǐng)(專(zhuān)利權(quán))人：中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所，
類(lèi)型：發(fā)明
國(guó)別省市：