本發(fā)明專利技術(shù)獲得了一種含有靶向HIV-1特異性siRNA的生物納米粒，該生物納米粒具有HIV-1特異基因沉默作用。所述siRNA選自SEQ?ID?NO:1～SEQ?ID?NO:6所示序列的1～6種。本發(fā)明專利技術(shù)在人CD4+T淋巴細胞和人造血干細胞（Human?Hematopoietic?Stem?Cell,hHSC）中檢測了獲得的生物納米粒對HIV活病毒的抑制效率，證實了其可直接作為防治艾滋病的藥物。
【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及一種具有Hiv-I特異基因沉默作用的SiRNA生物納米粒，本專利技術(shù)還涉及所述生物納米粒的制備方法，以及在制備防治艾滋病藥物方面的應用。
技術(shù)介紹
基因治療是當前艾滋病治療的新方法。RNA干擾(RNA interference, RNAi)又稱為依賴于RNA的基因沉默機制，是通過雙鏈RNA (double-strand RNA, dsRNA)特異性地抑制與其序列同源的靶基因mRNA表達的現(xiàn)象。即在胞質(zhì)中，雙鏈RNA引發(fā)了同源mRNA的降解，故也被稱為轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象(post-transcriptional gene-silencing, PTGS)。RNAi治療AIDS的研究現(xiàn)狀 siRNAs或miRNAs可以特異地結(jié)合靶mRNA，弓I起靶mRNA降解或翻譯抑制，最終導致基因特異性沉默。RNAi技術(shù)很可能為抗HIV治療的研究打開突破口。基因沉默靶點的確立HIV-I基因組編碼區(qū)由9個開放讀框組成，包括3個結(jié)構(gòu)基因(gag、pol、env),2個調(diào)節(jié)基因(tat、rev)和4個輔助基因(vif、vpr、vpu、nef )。非結(jié)構(gòu)基因曾被認為不是HIV-I病毒復制所必需的“非必需基因”，但是近年來越來越多的研究表明HIV-I的非結(jié)構(gòu)基因在病毒的致病機理、感染性、潛伏上都有著重要的作用，因此本專利技術(shù)將非結(jié)構(gòu)基因作為抗病毒治療的靶點。HIV-ITat蛋白不僅參與反式激活病毒的表達，還參與AIDS相關疾病的病理機理，如神經(jīng)毒性作用、致癌原性、免疫抑制原性等，在HIV-I的病毒復制及致病中都起了重要的作用。Rev蛋白可以與Rev應答元件(Rev response element, RRE)結(jié)合,介導未拼接和不完全拼接的mRNA從胞核向胞漿內(nèi)的轉(zhuǎn)運，促進病毒結(jié)構(gòu)蛋白和酶的合成，引發(fā)HIV基因表達由早期向晚期的轉(zhuǎn)換。Vpr可以在病毒復制的早期，反式激活HIV-1LTR，促進病毒基因的表達；介導和增強整合前復合體的核轉(zhuǎn)運；改變細胞基因的表達，誘導細胞周期G2/M期阻滯及細胞凋亡。病毒感染因子(Viral Infectivity Factor,Vif)可以抵抗載脂蛋白 B mRNA 編輯酶催化多妝樣蛋白 3G(human protein apoliproteinB mRNA-editingenzyme-catalytic polypeptide-1 ike~3G, AP0BEC3G)的抗病毒活性，增強 HIV-1 毒粒的感染力。研究顯示，HIV的gag和nef基因均可以通過RNAi進行沉默，RNAi方法治療艾滋病已經(jīng)成為艾滋病治療研究的熱點，研究顯示通過RNAi方法可以阻止HIV感染及抑制HIV復制。但其技術(shù)本身仍存siRNA穩(wěn)定性差、容易降解、無靶向性等問題。以重組病毒載體方式導入的siRNA雖然穩(wěn)定性較高，但是又帶來導入效率及載體基因整合等問題。人間充質(zhì)干細胞(Human Mesenchymal Stem Cells, hMSC)具有多向分化潛能，自身免疫原性低，取材方便。目前美國FDA已經(jīng)批準其用于自身免疫疾病及基因治療載體等多個方面的臨床試驗。
技術(shù)實現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的是篩選出針對HIV-I非結(jié)構(gòu)基因vpr，tat, vif, rev具有基因沉默作用的siRNAs序列，并將這些siRNAs序列構(gòu)建到慢病毒載體，在干細胞及其他傳代細胞中進行表達，制備一種含有對HIV特異性沉默的SiRNA的生物顆粒，以用于制備預防和治療艾滋病的藥物。本專利技術(shù)提供了一種靶向Hiv-I特異性SiRNA慢病毒為載體間充質(zhì)干細胞內(nèi)表達的siRNA生物納米粒，經(jīng)體外HIV活病毒攻擊實驗證實，可用于艾滋病毒的感染者和艾滋病患者的治療。本專利技術(shù)有如下創(chuàng)新點其一，本專利技術(shù)首次發(fā)現(xiàn)了可使HIV-I非結(jié)構(gòu)基因vpr，tat, vif, rev基因沉默的6個siRNAs序列本專利技術(shù)人針對HIV-I病毒基因組的vpr, tat, rev, vif基因的保守區(qū)域設計了 14條干擾RNA序列，經(jīng)實驗篩選，發(fā)現(xiàn)其中以下6條siRNA序列可以特異地靶向HIV-lvpr， tat, vif,rev 靶向siRXAs序列名稱卬列兮序列vprVpr—sh4SEQ ID MO: I gagtgaagc t gt tagacattatTat-1x4SEQ II) NO;2 gtgttgctttcattgccaaTal、rev tat and rev-1x6 SEQ ID NO:3 gacicaicaagcticiciarevrev-Ixl ISKQ ID XO:4 ggtggaatctcctacagta￥ifvilMSEQ ID NO:5 tatcaagcaggacataacaVifVif-2SEQ ID NO:6 agagactggcatttgggtc其二，本專利技術(shù)構(gòu)建了含有HIV env基因的重組慢病毒載體，篩選到能夠穩(wěn)定表達HIV跨膜蛋白gpl20和gp41的hMSC-env細胞系。該細胞系的名稱為XXXX，已于年月日保藏于XXXX，保藏號為XXXX所述細胞系可用于制備siRNA的生物納米粒。由于gpl20蛋白對⑶4分子具有親和性，使制備的siRNA生物納米粒具有靶向性。其三，本專利技術(shù)制備了一種含有HIV特異性siRNA的間充質(zhì)干細胞生物納米粒該生物納米粒載有上述靶向HIV-I特異性siRNA，所述siRNA的序列如上表所示的SEQID NO:I SEQ ID NO:6。該生物納米粒還具有以下特征I)大小在 10_500nm 之間；2)具有人間充質(zhì)干細胞(Human Mesenchymal Stem Cells, hMSC)外膜；3)鑲嵌病毒的膜蛋白gpl20。本專利技術(shù)在人CD4+T淋巴細胞和人造血干細胞(Human Hematopoietic StemCell, hHSC)中檢測了獲得的生物納米粒對HIV活病毒的抑制效率。經(jīng)此實驗證實，該生物納米粒可作為藥物直接用于治療和預防艾滋病。其五，本專利技術(shù)提供了上述含有HIV特異性siRNA的間充質(zhì)干細胞生物納米粒的制備方法方法是將含有上述siRNA序列(I 6個)的雙鏈DNA構(gòu)建到永久性表達目的基因的重組慢病毒載體中，在293T細胞中包裝出重組慢病毒；用收獲的重組病毒感染hMSC，加入嘌呤霉素篩選出表達siRNA的hMSC細胞系，經(jīng)篩選表達siRNA的hMSC細胞系可以持續(xù)高效的表達siRNA ;體外連續(xù)收獲細胞培養(yǎng)液，超速離心濃縮，獲得含有siRNA的生物納米粒。本專利技術(shù)的優(yōu)點和效果本專利技術(shù)結(jié)合siRNA的高效性和hMSC的低免疫原性，在提高siRNA的穩(wěn)定性的同時避免載體整合帶來的安全性問題。具體而言，選用針對HIV特異性的siRNA，以攜帶特異性的siRNA重組慢病毒將其導入到永生化的間充質(zhì)細胞中，在細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄復制，以吐胞的形式將帶有永生化間充質(zhì)細胞膜的siRNA生物納米粒分泌到細胞外，經(jīng)過濃縮純化后，用于HIV-I的基因治療。本專利技術(shù)方法提供的含有HIV特異性siRNA的生物顆粒具有以下優(yōu)點 I、提高了穩(wěn)定性利用生物膜包被的方式提高了 siRNA的穩(wěn)定性；2、提高了安全性，適用范圍廣本方法與現(xiàn)有技術(shù)的病毒載體導入方式相比又大大提高了安全性。其中間充質(zhì)干細胞制備的顆粒具有較為廣泛的組織親和性，同時免疫原性較低，從而本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護點】
一種生物納米粒，含有靶向HIV？1特異性siRNA，所述siRNA選自SEQ？ID？NO:1～SEQ？ID？NO:6所示序列的1～6種。
【技術(shù)特征摘要】
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：滕智平，馬晶，郝彥哲，楊怡姝，孫曉梅，曾毅，
申請(專利權(quán))人：曾毅，滕智平，楊怡姝，
類型：發(fā)明
國別省市：
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